用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用技術

用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用。本發明專利技術提供一種核苷酸序列，包括如下核苷酸序列：（1）SEQ??ID??NO.1中所示的核苷酸序列；（2）與（1）中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；（3）與上述（1）或（2）核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。本發明專利技術提供一種疫苗，將弓形蟲抗原雙酶切后連接pET28a表達載體，轉化入BL21(DE3)工程菌，誘導其高效表達，純化后得到可溶性蛋白，最后添加206佐劑制備而成。本發明專利技術制備的亞單位滅活疫苗具有較強的細胞免疫和體液免疫效果，能夠誘導機體的先天性免疫應答，分泌各種細胞炎性因子，從而有效地預防弓形蟲病。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫學和生物學領域，涉及一種用于預防羊弓形蟲感染的亞單位滅活疫苗和制備方法及其應用，主要涉及一種用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用。
技術介紹
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由弓形蟲（Toxoplasmagondii）引起的一種世界性分布的人獸共患寄生蟲病。弓形蟲病已成為我國亟待解決的重要公共衛生問題之一，其原因主要體現在以下幾點：一、人類弓形蟲感染率極高，一般為20%～50%，最高達94%，全球約有1/3的人感染弓形蟲，我國人群弓形蟲感染率為5%～20%。孕婦感染弓形蟲可影響胎兒的發育，嚴重者致畸甚至死亡，同時造成孕婦流產或早產；對于免疫抑制或免疫缺陷的病人，弓形蟲更是一個主要的機會性致病因素。據報道，孕婦感染弓形蟲后有30%～46%的機率將其傳播給胎兒，引起胎兒先天性感染，造成流產、死胎或先天性弓形蟲病；有6%～10%的艾滋病患者并發弓形蟲病，而且艾滋病病人所患腦炎中有50%是由弓形蟲感染所引起的。孕產婦和腫瘤患者弓形蟲抗體陽性率高達10%～60%。二、貓、犬、豬、羊、牛、兔等家畜感染弓形蟲非常普遍，其感染率高達10%～50%，豬、牛、羊的流產率達到30-40.7%；豬感染弓形蟲還可引起“無名高熱”，病死率達60%，因此弓形蟲病是造成家畜流產的重要因素之一，影響畜牧業生產。三、犬貓作為伴侶動物更是掀起一陣\犬貓寵物熱\，犬作為弓形蟲的重要中間宿主，貓作為唯一終末宿主，與人接觸親密，成為人類弓形蟲病的主要傳染源。四、弓形蟲可以感染所有的有核細胞，(豬牛羊雞鴨鵝等)動物感染率平均為15.4%，感染后弓形蟲以緩殖子形式遍布全身各個組織。這就造成弓形蟲很容易經肉、乳、蛋類大量流入食品市場，成為人類的傳染源，嚴重威脅著動物性食品的公共衛生安全。然而，迄今為止國內外仍然沒有理想的商品化防治弓形蟲病的疫苗和藥物，弓形蟲感染后可引起宿主保護性免疫應答，因此研制安全、有效的疫苗應是弓形蟲病良好的預防措施。弓形蟲疫苗的研制從60年代開始經歷了全蟲疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗和核酸（或DNA）疫苗等幾個階段。全蟲疫苗包括滅活疫苗和減毒活疫苗，但滅活疫苗對小鼠缺乏免疫保護性，因此無實際應用價值；弓形蟲速殖子經紫外線、放射線及化學試劑等處理后毒力減弱，能誘導較強的免疫應答，如Ts-4、T-263和S48，但減毒活疫苗存在減毒不充分和毒力返祖等危險，因此弱毒疫苗不能廣泛使用；亞單位疫苗是從蟲體裂解物或排泄-分泌抗原中提取特定組分作為疫苗，具有較好的免疫原性，但純化費時、費力，并且價格昂貴；基因工程疫苗是將弓形蟲抗原基因在高效表達載體中表達，從而得到大量純化的單一抗原。綜合以上論述可以發現，基因工程疫苗是弓形蟲疫苗發展的希望，具有潛在的開發應用價值。
技術實現思路
針對目前問題，本專利技術提供一種用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用，利用基因工程技術，克隆出弓形蟲HMG1基因，并將HMG1基因基因轉入工程菌進行表達，經誘導后重組抗原獲得高效表達，并對重組抗原的特異性和免疫原性進行生理性研究，表現良好的免疫原性。本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案是：本專利技術第一個目的是提供一種核苷酸序列，其特征在于，其中所述核苷酸序列為序號（1）或（2）或3中任意一種所述核苷酸序列：（1）SEQIDNO.1中所示的核苷酸序列；（2）與（1）中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；（3）與上述（1）或（2）所述核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。本專利技術第二個目的是提供一種載體，其特征在于，所述載體包括序號（1）或（2）或（3）所述任意一種核苷酸序列；所述載體為pET28a表達載體。本專利技術第三個目的是提供一種可溶性融合蛋白，其特征在于，所述可溶性融合蛋白的氨基酸序列由權利要求2所述的載體編碼。較佳地，所述一種可溶性融合蛋白包括弓形蟲VEG株HMG1蛋白，以及組氨酸純化標簽；其中編碼所述弓形蟲（VEG株）HMG1蛋白的DNA序列選自SEQIDNO.1；所述的純化標簽的氨基酸序列為SEQIDNO.3。優選，可溶性融合蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO.2。本專利技術第三個目的是提供一種宿主細胞，其特征在于，含有權利要求2所述的載體，或已用權利要求1所述的核苷酸序列轉化或轉染。本專利技術第四個目的是提供一種制備可溶性融合蛋白的方法，其特征在于，包括通過宿主細胞表達可溶性融合蛋白，并進行分離。本專利技術第五個目的是提供一種疫苗，其特征在于，所述疫苗包括權利要求1中序號（1）或（2）或（3）所述任意一種的核苷酸序列，以及醫學上可接受的載體。優選，所述疫苗是將弓形蟲抗原雙酶切后連接到pET28a表達載體，轉化入BL21(DE3)工程菌，誘導其高效表達，純化后得到的蛋白為可溶性融合蛋白，再添加206佐劑，制備而成，其疫苗保持其特有的免疫原性，適合于工業化生產。亞單位滅活疫苗適用于對2-3歲齡成年綿羊或懷孕1個月內的綿羊進行免疫注射。本專利技術的優點在于：選用了弓形蟲有效地抗原基因進行亞單位滅活疫苗的研制，根據該抗原基因具有與哺乳動物抗原非常相似的“TNF-α信號多肽區”，因此該抗原制備的亞單位滅活疫苗具有較強的細胞免疫和體液免疫效果，能夠誘導機體的先天性免疫應答，分泌各種細胞炎性因子，從而有效的預防弓形蟲病。附圖說明圖1.弓形蟲HMG1基因ORF擴增結果。附圖中：M,DL10000marker;HMG1，目的基因片段。圖2.弓形蟲HMG1基因重組表達蛋白的可溶性分析SDS-PAGE結果。附圖中：M,蛋白marker;S+,菌體經可溶性裂解也裂解后可溶性成分；S－，菌體經可溶性裂解也裂解后剩余的不可溶性成分。圖3.弓形蟲HMG1基因重組表達蛋白純化SDS-PAGE結果。附圖中：M,蛋白marker;r,重組HMG1蛋白。圖4.弓形蟲HMG1重組蛋白刺激小鼠RAW264.7細胞產生TNF-α水平。圖5.弓形蟲HMG1重組蛋白刺激小鼠樹突狀細胞產生IL-12水平。圖6.弓形蟲HMG1重組蛋白疫苗對小鼠抗弓形蟲感染的保護作用。圖7.弓形蟲HMG1重組蛋白疫苗對綿羊抗弓形蟲感染導致流產的保護作用。具體實施方式下面將結合實施例對本專利技術的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。實施例1：弓形蟲重組蛋白原核表達載體的構建參照弓形蟲HMG1基因序列開放型閱讀框和原核表達載體pET28a物理圖譜設計引物并引入酶切位點。上游：GGAATTCGCACCGAAGAAGGTGACAAAGAAG下游：CCCTCGAGTTTCTTCTTGTTGTAGAGAGAG用RNA提取試劑盒提取弓形蟲滋養體總RNA，RT-PCR試劑盒擴增HMG1基因（通用RT參數為：37℃60min;65℃20min;4℃5min。PCR參數為：95℃3min；94℃1min；59.5℃40s，72℃1min，30個循環后于72℃延伸10min），將PCR純化產物克隆至pGEM-Tvectorsystem經酶切和測序鑒定陽性克隆菌，陽性質粒經EcoRI和本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種核苷酸序列，其特征在于，其中所述核苷酸序列為序號(1)或(2)或(3)中任意一種所述核苷酸序列：(1)SEQ?ID?NO.1中所示的核苷酸序列；(2)與(1)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(3)與上述(1)或(2)所述核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種核苷酸序列，其特征在于，其中所述核苷酸序列為序號(1)或(2)或(3)中任意一種所述核苷酸序列：(1)SEQIDNO.1中所示的核苷酸序列；(2)與(1)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(3)與上述(1)或(2)所述核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。2.一種載體，其特征在于，所述載體包括權利要求1中任意所述的一種核苷酸序列。3.一種可溶性融合蛋白，其特征在于，所述可溶性融合蛋白的氨基酸序列由權利要求2所述的載體編碼。4.根據權利要求3所述的一種可溶性融合蛋白，其特征在于，包括弓形蟲VEG株HMG1蛋白，以及組氨酸純化標簽；其中編碼所述弓形蟲VEG株HMG1蛋白的DNA序列選自SEQIDNO.1；所述的純化標簽的氨基酸序列為SEQIDNO.3。5.根據權利要求4所述的一種可溶性融合蛋白，其特征在于，可溶性融合蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO.2。6.一種可溶性融合...

【專利技術屬性】
技術研發人員：侯峰，曹利利，陳星遠，王典，李思明，楊陽，
申請(專利權)人：艾堪生物科技天津有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12