適于酵母中的異源基因表達的啟動子制造技術

本發明專利技術涉及新的啟動子用于異源基因表達的用途，優選為用于耶氏酵母屬(genus?Yarrowia)的生物中基因表達的用途，涉及經遺傳修飾的耶氏酵母屬生物，并涉及用于通過培養所述經遺傳修飾的生物來生產生物合成產物的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請的交叉引用本申請要求申請日為2014年1月31日的美國臨時專利申請No.61/933,979的申請日權益，其公開內容通過提述在此并入本文。專利
本專利技術涉及新的啟動子用于異源基因表達的用途，優選為用于耶氏酵母屬(genusYarrowia)的生物中基因表達的用途，涉及經遺傳修飾的耶氏酵母屬生物，并涉及用于通過培養所述經遺傳修飾的生物來生產生物合成產物的方法。專利技術背景細胞中天然代謝過程產生多種生物合成產物，例如精細化學品，例如尤其是氨基酸、維生素、類胡蘿卜素，其用于多種工業分支中，包括人與動物食品、化妝品、以及制藥工業。其大規模生產是部分通過生物技術方法用微生物來進行的，所述微生物經過開發以產生和分泌大量具體所需的物質。例如，類胡蘿卜素是在細菌、藻類和真菌中從頭合成的。近年來，越來越多地嘗試利用油質(oleaginous)酵母和真菌作為生產精細化學品，尤其是生產維生素和類胡蘿卜素的生物。類胡蘿卜素(如葉黃素、玉米黃素、蝦青素和β胡蘿卜素)作為所謂的油性樹脂提取自例如耶氏酵母屬。這些油性樹脂既用作膳食補充劑的成分，也用于飼料行業(sector)中。酮式類胡蘿卜素(ketocarotenoids)，意即包含至少一個酮基的類胡蘿卜素，例如蝦青素、角黃素、海膽酮、3-羥基海膽酮、3’-羥基海膽酮、金盞花紅素(adonirubin)和金盞花黃素(adonixanthin)，是天然抗氧化劑和色素，其由一些藻類、生物和微生物作為次級代謝物產生。這些分子在能生產其的生物(如酵母和細菌)中的生物合成已得到了詳細表征(Weinheim等,(1996)Ullmann'sEncyclopediaofIndustrialChemistry,\Vitamins\,Vol.A27,pp.443-613；BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Michal,G.Ed.(1999)；Ong,A.S.,Niki,E.和Packer,L.,(1995)\Nutrition,Lipids,HealthandDisease\ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysiaandtheSocietyforRreeRadicalResearch-Asia，舉辦于1994年9月1-3日，于Penang,Malaysia,AOCSPress,Champaign,ILX,374S)。具體而言，類胡蘿卜素在耶氏酵母中的生物合成描述于WO2006/102342中。由于酮式類胡蘿卜素的著色特性，將其與特別是蝦青素用作家畜營養中(尤其是在鱒魚、鮭魚和蝦的養殖中)的著色劑。因此，用于生產天然生物合成產物(并且尤其是類胡蘿卜素)的經濟的生物技術方法是非常重要的。WO2008/042338公開了多個用于在耶氏酵母中過表達類胡蘿卜素生物合成基因的啟動子。EP0220864A中公開了一種的啟動子。該文獻描述了解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)啟動子XPR2。該XPR2酵母啟動子在缺乏偏好的碳和氮源的培養基上僅在pH6.0以上有活性，并且完全誘導需要在培養基中高水平的蛋白胨(Ogrydziak,D.M.,Demain,A.L.,和Tannenbaum,S.R.,(1977)Biochim.Biophys.Acta.497:525-538.；Ogrydziak,D.M.和Scharf,S.J.,(1982)Gen.Microbiol.128:1225-1234.)。用于在酵母(例如耶氏酵母)中表達基因的另一種啟動子，描述于WO1997/044470中。然而，迄今為止使用的啟動子無法完全滿足在耶氏酵母中進行高表達的需求。因此需要提供更好地滿足這些需求的啟動子。因此，本專利技術的目的是提供新的改進的酵母啟動子，尤其用于在酵母中克隆表達，而且用于在選擇的表達系統中異源表達上述合意的精細化學品。專利技術概述本專利技術涉及一種重組核酸分子，其包含：a)與SEQIDNO:1(在此稱為HSP)或SEQIDNO:2(在此稱為HYP)的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸序列，或b)在嚴格條件下與核酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2雜交的核酸序列，或c)a)或b)的序列的功能上等同的片段。在一個方面，本專利技術涉及一種重組核酸分子，其包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。在本專利技術的一個具體方面，所述重組核酸分子作為啟動子發揮功能。所述重組核酸分子用于在酵母中調控基因的表達。在一個實施方案中，所述酵母是耶氏酵母屬的生物。在一個實施方案中，所述酵母是解脂耶氏酵母的菌株。在另一個實施方案中，所述被調控的基因對于耶氏酵母屬的生物體是異源的。在一個實施方案中，所述重組核酸分子與編碼蛋白的基因是功能上相連的(functionallylinked)。在一個實施方案中，所述基因與一個或多個其他調控信號是功能上相連的。在一個具體實施方案中，所述功能上相連的基因選自編碼蛋白的核酸的組，所述蛋白來自：a)有機酸的生物合成途徑，或b)脂質和脂肪酸的生物合成途徑，或c)二醇的生物合成途徑，或d)芳香族化合物的生物合成途徑，或e)維生素的生物合成途徑，或f)類胡蘿卜素，特別是酮式類胡蘿卜素的生物合成途徑。在一個實施方案中，本專利技術所述的重組核酸分子是載體。本專利技術還涉及經遺傳修飾的微生物，其包含上述的重組核酸分子。在一個實施方案中，所述微生物是耶氏酵母屬的成員。在另一個實施方案中，上述的重組核酸分子用于在宿主微生物中表達一個或多個基因，其中至少一個或多個基因的表達速率(expressionrate)與野生型相比是提高的。在一個具體實施方案中，所述基因在宿主微生物中的表達調控通過如下實現：a)將一個或多個上述重組核酸分子引入宿主微生物的基因組中，從而使宿主微生物一個或多個內源基因的表達在引入的重組核酸分子控制下發生；b)將一個或多個基因引入所述微生物的基因組中，從而使所述一個或多個引入的基因的表達在上述重組核酸分子控制下發生，所述重組核酸分子對于宿主微生物是內源的；或c)將一個或多個核酸構建體引入宿主微生物中，其中所述一個或多個核酸構建體包含至少一個上述重組核酸分子，且所述重組核酸分子與一個或多個要表達的基因是功能上相連的。本專利技術還涉及生產生物合成產物的方法，包括如下步驟：a)在培養基中培養耶氏酵母屬的經遺傳修飾的微生物，其中所述經遺傳修飾的微生物包含上述的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子與編碼蛋白的基因是功能上相連的；及b)生產步驟a)中制成的生物合成產物。在一些實施方案中，所述生物合成產物分泌至培養基中。在一些實施方案中，所述生物合成產物在微生物中積累。在一些實施方案中，將所述生物合成產物從分離的微生物生物質回收。在一些實施方案中，所述生物合成產物是類胡蘿卜素。附圖簡述圖1和圖2分別顯示了搖瓶實驗中測試的兩個啟動子的平均玉米黃素和蝦青素水平本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組核酸分子，其包含：a)與SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸序列，或b)在嚴格條件下與核酸序列SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2雜交的核酸序列，或c)a)或b)的序列的功能上等同的片段。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.01.31 US 61/933,9791.一種重組核酸分子，其包含：a)與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸序列，或b)在嚴格條件下與核酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2雜交的核酸序列，或c)a)或b)的序列的功能上等同的片段。2.權利要求1的重組核酸分子，其中所述多核苷酸序列與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性。3.權利要求1或2的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子作為啟動子發揮功能。4.權利要求1或2的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子用于在酵母中調控基因的表達。5.權利要求4的重組核酸分子，其中所述酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)菌株。6.權利要求5的重組核酸分子，其中所述基因對于耶氏酵母屬(genusYarrowia)的生物體是異源性的。7.前述任一項權利要求的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子與編碼蛋白的基因是功能上相連的。8.權利要求7的重組核酸分子，其中所述基因選自編碼蛋白的核酸的組，所述蛋白來自：a)有機酸的生物合成途徑，b)脂質和脂肪酸的生物合成途徑，c)二醇的生物合成途徑，d)芳香族化合物的生物合成途徑，e)維生素的生物合成途徑，或f)類胡蘿卜素，特別是酮式類胡蘿卜素(ket...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J·L·麥格拉斯，B·謝弗勒，P·S·約爾杰，
申請(專利權)人：帝斯曼知識產權資產管理有限公司，
類型：發明
國別省市：荷蘭;NL