用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒及其使用方法和檢測系統技術方案

本發明專利技術提供一種用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒及其使用方法和檢測系統，試劑盒包括核酸分離與純化試劑，DNA亞硫酸鹽轉化試劑，KRAS基因突變檢測試劑，BMP3和NDRG4基因甲基化檢測試劑，糞便潛血檢測試劑；其中核酸分離與純化試劑用于分離及純化出糞便樣本中的人源性DNA；DNA亞硫酸鹽轉化試劑用于將純化的部分人源性DNA進行亞硫酸鹽轉化，用于后續BMP3和NDRG4基因甲基化的檢測。本發明專利技術通過聯合檢測糞便樣本中的DNA和便潛血兩種指標，用于結直腸癌的早期篩查，可實現相較于FOBT檢測方法在結直腸癌特別是進展期腫瘤的檢測上具有更高的敏感性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物技術及診斷研究領域，涉及一種用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒及其使用方法和檢測系統。
技術介紹
結直腸癌也被稱為大腸癌，發生在結腸(大腸)或直腸中，通常發展緩慢，是中國城鎮第二高發癌癥，40歲以上無癥狀人群中6％患有早期腸癌。隨著食品結構和生活習慣的改變，以及環境問題的日益突出，導致大腸癌發生率快速增長，據《中國腫瘤登記年報》報道顯示，腸癌是目前中國城市發病率僅次于肺癌的第二大癌癥，主要包括結腸癌與直腸癌兩大類。目前我國每年新增結直腸癌確診病例44萬例，每年死亡患者多達23萬人。國家癌癥早診早治項目專家委員會2013年研究報告指出，中國40歲以上高危人群患進展期腺瘤和早期腸癌比率為6％。這些癌變病灶不及時切除，90％的情況下將會轉化為惡性腸癌。由于大部分患者在早期并未發現重視并得到及時治療，腸癌死亡率居高不下。對于在早期階段被篩查到的患者，超過90％可以被治愈。結直腸癌有許多共同特點：大多數腸癌形成之前已經以息肉(異常突起)或腺瘤(腺上皮良性腫瘤)的形式在發病部位緩慢發展多年，在此期間患者無任何不適。腺瘤是一種良性，非癌性腫瘤。隨著時間的推移，部分腺瘤可轉變為癌癥。在癌變過程中，腫瘤細胞侵入腸壁，與血管或淋巴管融合，通過吸收患者養分迅速擴增。后期，癌細胞通過淋巴管侵入附近的淋巴結或身體的其它器官，如肝臟等，形成癌擴散。結直腸癌通常發展至晚期才有明顯癥狀顯現(如腹痛，便血等)。由于大多數中國患者沒有進行癌癥早篩查的意識，發現癥狀后才到醫院檢查，至結直腸癌確診時，癌細胞已經擴散，后期療效不明顯，致使中國近半數腸癌患者生存期不超過五年。如果將腸癌早期篩查技術在中國進行普及推廣，預計結直腸癌死亡率可從現有水平降低50％以上。結直腸癌屬于篩查效果明確的惡性腫瘤，通過篩查早期發現結直腸癌可有效提高患者生存率，降低死亡率；而對癌前腺瘤(直徑≥1厘米)的早期診斷和隨后的摘除手術則可降低結直腸癌的發病率。篩查對象可分為一般危險人群和高危人群。在西方發達國家，結直腸癌篩查是針對一般危險人群開展的普查項目，鼓勵所有年齡大于50歲的人常規性地接受腸鏡和糞便潛血試驗(FecalOccultBloodTest，FOBT)檢查。而在我國，雖然在高危人群中開展過“伺機性篩查”，但是尚未有一個針對一般危險人群的結直腸癌篩查項目。隨著社會經濟的發展和人們健康意識的提高，我國結直腸癌篩查將會從“伺機性篩查”向系統性篩查過渡。結直腸癌篩查的目的將不僅僅是早期診斷結直腸癌，癌前腺瘤的早期發現也將會受到重視；因為結直腸腺瘤的癌變通常耗時10年左右，所以有足夠的時間通過篩查和隨后的腺瘤摘除手術阻斷其癌變過程，達到預防腸癌的目的。目前結直腸癌的篩查方法主要是結腸鏡檢查和糞便潛血試驗。纖維結腸鏡是迄今為止最準確的結直腸癌篩查方法，腸鏡加病理活檢被認為是結直腸癌篩查和診斷的金標準。在美國和歐洲的有些國家，纖維結腸鏡被廣泛地用于結直腸癌的篩查，50歲以上的人每10年被要求做一次腸鏡，但是因為腸鏡的侵入性和腸道準備時的不適感，有超過半數的美國人不愿接受腸鏡檢查。在我國，適齡人群接受腸鏡篩查手段的不足10％，致使我國發現腸癌多為中晚期，而發現后5年存活率不足50％，低于美國約20個百分點。另外，最近有研究表明腸鏡對右側結腸內常見的扁平息肉的診斷效果不好，腸鏡篩查并不能降低右側結腸癌的死亡率。另外，在我國還要考慮到是否有足夠的醫療資源來支持采用腸鏡篩查這一龐大的項目。CT腸鏡是一種新型的結直腸癌篩查方法，有研究表明其診斷敏感性可以接近腸鏡；但是該法也要求患者做腸道整備，且價格昂貴，不適合普及使用。另外，CT腸鏡作為一種篩查手段可能使整個人群受到X線輻射，有導致癌癥或血液系統疾病發生的可能。FOBT檢測是唯一被應用于結直腸癌大系列人群篩查且得到循證醫學證實可有效降低死亡率的方法，其以糞便中血紅蛋白為檢測靶標，相對其他方法，其可以做到無創性，不需要腸道準備，方便取材，以及更好的經濟性。但也FOBT檢測存在很多弊端：其檢測的是腫瘤伴隨癥狀—出血，可能出現因暫停出血或腫瘤早期無出血癥狀造成的漏診，影響對腫瘤特別是腫瘤早期病變的檢測敏感性，目前主流的FOBT檢測技術對結直腸癌的敏感性為60-87％，而對進展期腫瘤敏感性為20-43％。
技術實現思路
本專利技術針對上述缺點，提供了一種用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒及其使用方法和檢測系統，通過取病人的糞便樣本，聯合DNA檢測結果和糞便隱血結果，用于早期結直腸癌和癌前腺瘤的篩查，具有更高的靈敏度。為實現上述目的，本專利技術采取下述技術方案來實現：本專利技術提供一種用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒，包括核酸分離與純化試劑，DNA亞硫酸鹽轉化試劑，KRAS基因突變檢測試劑，BMP3和NDRG4基因甲基化檢測試劑，糞便潛血檢測試劑；其中核酸分離與純化試劑用于分離及純化出糞便樣本中的人源性DNA；DNA亞硫酸鹽轉化試劑用于將純化的部分人源性DNA進行亞硫酸鹽轉化，用于后續BMP3和NDRG4基因甲基化的檢測。進一步，所述試劑盒還包括樣本收集試劑，所述樣本收集試劑分為兩種，分別用于供基因檢測的樣本和用于糞便隱血檢測的樣本。進一步，其中KRAS基因突變檢測試劑中包含1-3mM的MgCl2、0.1-1mM的dNTP、2.5-5U/反應的Taq酶、20-50mM的KCl、1-4mM的Tris、每種KRAS突變型0.4-0.9uM的引物、每種KRAS突變型10uM的的探針。進一步，BMP3和NDRG4甲基化檢測試劑中包含2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、2U/反應的Taq酶、20mM的Tris-HCl、50Mm的NH4+、每種甲基化突變0.75mM的引物、每種甲基化突變0.25mM的的探針。本專利技術還提供一種上述用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒的使用方法，所述使用方法包括以下步驟：樣本收集，分別收集用于基因檢測和糞便隱血檢測的樣本；樣本的處理與檢測，核酸的分離與純化，采用核酸分離與純化試劑，通過磁珠法分離核酸，然后通過離心柱法純化核酸；純化后的核酸，一部分用于檢測KRAS基因突變，采用KRAS基因突變檢測試劑檢測樣本中KRAS基因突變；另一部分采用DNA亞硫酸鹽轉化試劑經過亞硫酸鹽轉化法對其DNA進行轉化，然后檢測樣本中的BMP3和NDRG4基因甲基化；糞便潛血檢測，對樣本章的血紅蛋白進行檢測。進一步，上述使用方法還包括檢測得到的參數關聯計算方法，所述計算方法包括以下步驟：以糞便為檢測樣本，以KRAS基因突變、BMP3和NDRG4基因甲基化以及血紅蛋白為檢測靶標，4項檢測結果被賦予不同的權重，通過邏輯運算公式進行結果判定；所述邏輯運算公式為：P＝eK/(1+eK)K＝a*Ct1+b*Ct2+c*Ct3+d*FOBT+X上式中，P為結直腸癌綜合指數；e為自然常數；a,b,c,d,X為常數；Ct1為KRAS和內參基因Ct值差值；Ct2為BMP3和內參基因Ct值差值；Ct3為NDRG4和B2M基因Ct值差值；FOBT為血紅蛋白測定值。進一步，所述a,b,c,d,X通過臨床測試數據分布確定。進一步，所述P值為檢測綜合指數，根據臨床分布確定的判定閾值，P值≥閾值時檢測結果為陽性，p值＜閾值時為陰性。另外，Ct1，Ct2，Ct3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸分離與純化試劑，DNA亞硫酸鹽轉化試劑，KRAS基因突變檢測試劑，BMP3和NDRG4基因甲基化檢測試劑，糞便潛血檢測試劑；其中核酸分離與純化試劑用于分離及純化出糞便樣本中的人源性DNA；DNA亞硫酸鹽轉化試劑用于將純化的部分人源性DNA進行亞硫酸鹽轉化，用于后續BMP3和NDRG4基因甲基化的檢測。

【技術特征摘要】
1.一種用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸分離與純化試劑，DNA亞硫酸鹽轉化試劑，KRAS基因突變檢測試劑，BMP3和NDRG4基因甲基化檢測試劑，糞便潛血檢測試劑；其中核酸分離與純化試劑用于分離及純化出糞便樣本中的人源性DNA；DNA亞硫酸鹽轉化試劑用于將純化的部分人源性DNA進行亞硫酸鹽轉化，用于后續BMP3和NDRG4基因甲基化的檢測。2.根據權利要求1所述的用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括樣本收集試劑，所述樣本收集試劑分為兩種，分別用于供基因檢測的樣本和用于糞便隱血檢測的樣本。3.根據權利要求1所述的用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒，其特征在于，其中KRAS基因突變檢測試劑中包含1-3mM的MgCl2、0.1-1mM的dNTP、2.5-5U/反應的Taq酶、20-50mM的KCl、1-4mM的Tris、每種KRAS突變型0.4-0.9uM的引物、每種KRAS突變型10uM的的探針。4.根據權利要求1所述的用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒，其特征在于，BMP3和NDRG4甲基化檢測試劑中包含2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、2U/反應的Taq酶、20mM的Tris-HCl、50Mm的NH4+、每種甲基化突變0.75mM的引物、每種甲基化突變0.25mM的的探針。5.一種如權利要求1-4任意一項所述的用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟：樣本收集，分別收集用于基因檢測和糞便隱血檢測的樣本；樣本的處理與檢測，核酸的分離與純化，采用核酸分離與純化試劑，通過磁珠法分離核酸，然后通過離心柱法純化核酸；純化后的核酸，一部分用于檢測KRAS基因突變，采用KRAS基因突變檢測試劑檢測樣本中KRAS基因突變；另一部分采用DNA亞硫酸鹽轉化試劑經過亞硫酸鹽轉化法對其DNA進行轉化，然后檢測樣本中的BMP3和NDRG4基因甲基化；糞便潛血檢測，對樣本章的血紅蛋白進行檢測。6.根據權利要求5所述的用于早期結直腸癌輔助診斷的試劑盒的使用方法，其特征在于，樣本檢測得到的數據的計算方法包括以下步驟：以糞便為檢測樣本，以KRAS基因突變、BMP3和NDRG4基因甲基化以及血紅蛋白為檢測靶標，4項檢測結果被賦予不同的權重，通過邏輯運算公式進行結果判定；所述邏輯運算公式為：P＝eK/(1+eK)K＝...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊姣，鄭偉賢，陳一友，呂寧，
申請(專利權)人：杭州諾輝健康科技有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33