一種香蕉黑星病菌分子檢測引物及檢測方法技術

本發明專利技術涉及一種香蕉黑星病菌分子檢測引物及其檢測方法，屬于農作物病害檢測和生物技術領域。該特異性引物包括上游引物BMF：5’?GCTACAACGCCGAAATGACC?3’，下游引物BMR：5’?GACGTTGCCCAATACCAAGC?3’。所發明專利技術的檢測引物及檢測方法可用于香蕉黑星病菌純培養的檢測鑒定，也能對香蕉葉片和果實進行檢測；本發明專利技術檢測引物特異性強、靈敏度高，檢測方法實用性好，操作簡便快捷；本發明專利技術能實現香蕉黑星病的早期檢測，還能有效區分香蕉上相似的炭疽病、彎孢霉葉斑病、黑斑病、磚格孢葉斑病、暗雙孢葉斑病，對香蕉黑星病的早期預警和防控，防治病害的擴散蔓延具有重要意義。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種香蕉黑星病菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于香蕉黑星病菌的快速分子檢測，同時可實現田間香蕉黑星病菌的早期診斷和病菌的監測鑒定，屬于農作物病害檢測和生物

技術介紹
香蕉是世界上產量最大的水果作物，也是世界著名的熱帶、亞熱帶水果，。也是中國熱帶亞熱帶的主要水果，香蕉其具有獨特的品味和較高的營養價值，歷來堪稱一種上乘的保健果品。中國是世界香蕉主產國之一，具有悠久的栽培歷史，也是世界的香蕉種植生產大國之一，香蕉的栽培面積和產量居全國水果的第四位。香蕉黑星病又稱黑痣病、雀斑病，可為害香蕉葉片、果柄和果實，在我國各香蕉種植區普遍存在。發病時葉片及中脈產生許多散生或群生的突起小黑斑，直徑約lmm，其周緣淡褐色，中部稍下陷，上著生小黑粒。病斑密集成塊斑，最后導致葉片枯黃，果實發病，癥狀常在斷蕾后2～4周出現，多在果指彎腹部分，嚴重時全果均有，初期為紅棕色、外圍暗綠色水暈，隨著果實肉度增大，病斑密度增大，嚴重的擴展至全果，影響果實的外觀和耐貯性，近年來香蕉黑星病在我國香蕉產區普遍發生且為害日益嚴重，已成為香蕉生產上的重要病害之一。香蕉黑星病菌(Phyllostictamusarum)在PDA、PSA和V8等常見培養基上生長很緩慢，在進行分離時菌落常常被雜菌所覆蓋，而且分生孢子器產生時間晚。難以在早期鑒別。到1972年還未獲得純培養，除此之外以癥狀為基礎的病害常規診斷技術，需要采用柯赫氏法則經過病原菌分離培養、病原菌鑒定、接菌、癥狀分析等步驟，耗時長、效率低、準確性差，難以做到病害發生時及時檢測和有效控制病原菌的傳播和病害流行，難以滿足香蕉黑星病診斷的實際需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、結果可靠、靈敏度高的快速診斷技術。近年來，分子生物學技術發展迅速，隨著分子生物學技術在植物病理學科不斷發展和應用，一些分子標記技術為植物病原菌的診斷檢測提供了新的途徑，其中PCR（polymerasechainreaction）技術以特異性強、靈敏度高、方便快捷等特點被用于植物病原菌的診斷。真菌核糖體轉錄間隔區（internaltranscribedspacer,ITS）序列種內的保守性和科屬種間可變性的特點，設計特異性引物進行PCR，對病原菌進行快速檢測和鑒定的技術已受到廣泛的應用，國內外研究人員已成功開發出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘潰瘍病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方銹病菌等多種病原菌的特異性引物和檢測方法，實現了快速、靈敏和準確的鑒定。但目前有關香蕉黑星病菌分子檢測的研究尚未見報道。
技術實現思路
針對現有技術中對香蕉黑星病菌的檢測和鑒定主要基于病原形態學特征，香蕉黑星病菌生長緩慢，分離難度大，分離程序繁瑣、耗死長、對鑒定經驗要求高、準確度低，難以滿足香蕉黑星病診斷的實際需要問題，提供了一種香蕉黑星病菌分子檢測引物及其檢測方法。為實現上述目的，本專利技術采取了以下技術方案：本專利技術首先提供了一種香蕉黑星病菌分子檢測引物，其核苷酸序列為：上游引物BMF：5’-GCTACAACGCCGAAATGACC-3’；下游引物BMR：5’-GACGTTGCCCAATACCAAGC-3’。所述引物BMF和BMR對香蕉黑星病菌特異性擴增出382bp的產物。本專利技術還提供了一種香蕉黑星病菌的快速檢測方法，包括以下步驟：(1)從香蕉葉片或果實中提取DNA；用于檢測病原菌純培養物時，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA；用于檢測香蕉組織是否存在香蕉黑星病菌時，采用NaOH快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA；(2)以提取香蕉葉片或果實的DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應體系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環；72℃延伸10min；(3)上步所得的PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據擴增產物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出382bp的產物，則可判定所述的香蕉葉片或果實中存在香蕉黑星病菌，否則所述的香蕉葉片或果實中不存在香蕉黑星病菌。本專利技術的積極有益效果在于：（1）準確性高：本專利技術是根據真菌核糖體轉錄間隔區（rDNA-ITS）序列在真菌種內的高度保守性和科屬種間可變性的特點設計對香蕉黑星病菌具有特異擴增作用的PCR引物。已經對不同地理來源的香蕉黑星病菌、攜帶香蕉黑星病菌的植物葉片、攜帶香蕉黑星病菌的果皮和健康的香蕉組織進行了檢測驗證，只有香蕉黑星病菌和攜帶該病菌的香蕉組織能特異性地擴增出一條382bp的電泳條帶，說明本專利技術所設計的引物用于檢測香蕉黑星病菌準確可靠；（2）特異性強：本專利技術所設計的引物對香蕉黑星病菌具有很強的特異性，能夠用于區別香蕉黑星病菌、香蕉炭疽病、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉磚格孢葉斑病菌及香蕉暗雙孢葉斑病菌等香蕉上常見的病原菌，從而能有效區分發生在香蕉上癥狀特征相似的病害；（3）靈敏度高：本專利技術將設計的特異引物與ITS基因通用引物（ITS1/ITS4）聯合起來進行巢式PCR擴增后，對香蕉黑星病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到1fg；（4）適用性廣、實用性好：本專利技術的香蕉黑星病菌的檢測方法，不僅能對病菌菌絲體進行檢測，也能對感病的香蕉葉片和果皮進行檢測，可實現香蕉黑星病菌的早期檢測，即在病害顯癥前進行檢測，對預防香蕉生長期和采摘后黑星病的爆發流行有重要意義。（5）、操作簡便快速：本專利技術只需進行DNA提取、PCR擴增和瓊脂糖電泳后即可判定結果，一般整個檢測過程可在數小時內完成，操作簡便快捷。附圖說明圖1為本專利技術引物對香蕉黑星病菌特異性擴增電泳圖：其中泳道M為2000bpDNAMarker，泳道2、泳道3為香蕉黑星病菌，泳道4-11分別為：香蕉炭疽病菌、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉磚格孢葉斑病菌、香蕉暗雙孢葉斑病菌、香蕉枯萎病菌、蘆筍莖枯病菌、陰性對照。圖2為本專利技術引物香蕉黑星病菌的靈敏性檢測擴增電泳圖：A：普通PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bpDNAMarker，泳道2-11分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、陰性對照、陽性對照；B為巢式PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bpDNAMarker，泳道2-13分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、陰性對照、陽性對照。圖3為本專利技術香蕉葉片和香蕉果皮種黑星病菌檢測擴增電泳圖，其中泳道M為2000bpDNAMarker，泳道2-10分別為自然發病的香蕉葉片、自然發病香蕉果實、人工接種發病的香蕉葉片、人工接種后發病初期香蕉果實、健康香蕉葉片、健康的香蕉果皮、健康的香蕉果柄、陰性對照、陽性對照。具體實施方式為了使本專利技術所述的內容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本專利技術所述的技術方案做進一步的說明。下述實施例中所使用的試驗方本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種香蕉黑星病菌分子檢測引物，其特征在于：引物的核苷酸序列為：上游引物BMF：5’?GCTACAACGCCGAAATGACC?3’下游引物BMR：5’?GACGTTGCCCAATACCAAGC?3’。

【技術特征摘要】
1.一種香蕉黑星病菌分子檢測引物，其特征在于：引物的核苷酸序列為：上游引物BMF：5’-GCTACAACGCCGAAATGACC-3’下游引物BMR：5’-GACGTTGCCCAATACCAAGC-3’。2.根據權利要求1所述香蕉黑星病菌分子檢測引物，其特征在于：所述上游引物BMF和下游引物BMR對香蕉黑星病菌特異性擴增出382bp的產物。3.一種香蕉黑星病菌的快速檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)提取香蕉葉片或果實的DNA；(2)以提取的香蕉葉片或果實的DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應體系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dN...

【專利技術屬性】
技術研發人員：杜宜新，石妞妞，陳福如，阮宏椿，楊秀娟，甘林，代玉立，
申請(專利權)人：福建省農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：福建;35