一種玻璃海鞘多肽的應用制造技術

本發明專利技術屬于生化與生物醫藥領域,具體的說是一種玻璃海鞘多肽的應用。玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。將玻璃海鞘多肽經MTT測定、掃描電鏡觀察、細胞核染色觀察、線粒體膜電位變化等體外方法證明了該多肽對多種腫瘤細胞具有顯著的抗腫瘤作用,可引起腫瘤細胞凋亡,其誘導機理系通過細胞凋亡途徑,說明了此玻璃海鞘多肽在預防和治療腫瘤方面的作用和新途徑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生化與生物醫藥領域，具體的說是一種玻璃海鞘多肽的應用。
技術介紹
惡性腫瘤是人類健康的第一殺手，其發病率和致死率均居各中疾病之首。抗癌藥物的研究和開發已成為本世紀新藥研究的重大課題。從海洋中分離純化抗腫瘤活性物質已經成為抗癌藥物研究的熱點之一。我們在篩選抗腫瘤藥物過程中發現從玻璃海鞘中分離純化的一種多肽(PI5931)具有很強的抑制腫瘤細胞生長的作用，對發展成為新的抗癌藥物具有很大潛力。海鞘(Ascidian)屬于脊索動物門(Chordates)，尾索動物亞門(Urochordata)，海鞘綱(Ascidiacea)，全世界大約有1600種。從中發現了許多具有新的結構和生物學功能的環肽、線性肽及desipeptides。Didemnins(膜海鞘素)最早是從加勒比海鞘中分離的，是desipeptides的家族，具有抗腫瘤，抗病毒和免疫抑制作用，其中DidemninsB是抗腫瘤活性最強的環肽(體外對L1210的IC50為2.5ng/ml)，也是第一種進入臨床試驗的海洋天然產物。由兩種海鞘Didemnumcuculiferum和Polysyncrantonlithostrotum中發現的一種13個氨基酸的環肽可顯著抑制微管聚合，并能延長小鼠p388淋巴細胞白血病的生存期；但由玻璃海鞘(Cionaintestinalis)中分離出抗腫瘤蛋白一直未見報道。玻璃海鞘屬于內性目、玻璃海鞘科，為我國北方海水養殖產業的主要生物污染物，國內有關玻璃海鞘的研究僅僅局限于胚胎發育，生理生化，脂肪酸提取上。董平原等從玻璃海鞘中分離得到了一種具有抗新生血管生成活性和抗腫瘤作用的玻璃海鞘多肽BLF-2，對斑馬魚胚胎血管生成具有顯著的抑制活性，對人臍靜脈內皮細胞的遷移和管腔形成具有顯著的抑制作用。由玻璃海鞘中提取分離出抗腫瘤多肽一直未見報道，本專利技術采用多種分離純化手段從玻璃海鞘中分離得到一種新的具有抗腫瘤作用的多肽PI10，實驗證實，該多肽在體外具有誘導人肝癌細胞株BEL-7402凋亡的活性，并對多種腫瘤細胞均具有良好的細胞毒活性。與現有的化療藥物相比，抗腫瘤多肽類藥物具有毒副作用小、不易產生耐藥性等優點，有望成為新型的抗腫瘤藥物。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種玻璃海鞘多肽的應用。為實現上述目的本專利技術采用的技術方案為：玻璃海鞘多肽的應用：玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述玻璃海鞘多肽在制備抗人肺癌細胞、人宮頸癌上皮細胞、人肝癌細胞、人結腸癌細胞、人乳腺癌細胞和人神經膠質瘤細胞藥物中的應用。所述玻璃海鞘多肽按如下方法制備1)將新鮮的海鞘通過有機溶劑以4-20℃進行沉淀提取1-3次，沉淀物通過濾膜進行超濾截留大于5KDa物質，待用；2)將上述截留大于5KDa物質，以0.05-0.5M的NaCl緩沖液作為洗脫液進行DEAE陰離子交換柱層析，收集0.15MNaCl緩沖液洗脫組分，待用；3)將上述收集的洗脫組分經Superdex75分子篩凝膠層析，用超純水做洗脫液，流速為0.8-1.2ml/min，收集洗脫組分，待用；4)將上述洗脫組分經HPLCC-18反相柱分離純化，洗脫液為A液和B液，進行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的90％，B液占總洗脫液體積的10％，B液每分鐘1％的速率上升，流速為0.5-0.8ml/min，當B液占總洗脫液體積的28.4％時出現活性組分，即得到N-末端序列為YQPDKFMLRGELRNN，分子量為5931Da的單一組分玻璃海鞘多肽；其中A液為A液總體積0.1％的TFA和A液總體積99.9％的超純水，B液為B液總體積0.1％的TFA和B液總體積99.9％的乙腈。所述步驟1)通過有機溶劑沉淀時采用體積百分含量為10％-90％的丙酮水溶液，并且每次沉淀時間為12小時。所述步驟1)通過有機溶劑沉淀時采用體積百分含量為60％-80％的丙酮水溶液。本專利技術所具有的優點：1.本專利技術中涉及的多肽是一種海洋來源的物質，由于海洋生態環境的特殊性，使得海洋生物具有某些陸上生物所沒有的活性物質，這些活性物質往往具有結構新穎、高活性、耐藥性低等特點，可以為新藥研究和開發提供模式結構和醫藥前體。2.該多肽在提取過程中經過了70℃高溫加熱，加熱后仍保持活性不變說明該多肽具有熱穩定性，將來制成藥后能延長藥品的貨架壽命。3.本專利技術將玻璃海鞘多肽經MTT測定、掃描電鏡觀察、細胞核染色觀察、線粒體膜電位變化等體內外方法證明了該多肽對多種腫瘤細胞具有顯著的抗腫瘤作用，可引起腫瘤細胞凋亡，其誘導機理系通過細胞凋亡途徑，說明了此玻璃海鞘多肽在預防和治療腫瘤方面的作用和新途徑。具體地說，就是通過體外實驗闡明了玻璃海鞘多肽誘導細胞凋亡的途徑，確定此多肽在惡性腫瘤的預防和治療方面的用途。附圖說明圖1為本專利技術實施例提取的多肽PI5931用ABI公司的QTrap離子噴霧質譜儀(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)以增強的方式測定其分子量。質譜儀配以TurbolonSpraysource并以陽離子模式操作圖2為本專利技術實施例提取的多肽PI5931的Tricine-SDS-Page電泳分析圖。圖3為本專利技術實施例提取的多肽PI5931處理BEL-7402癌細胞，掃描電鏡下正常細胞與細胞凋亡形態變化。(其中圖3A為正常細胞，圖3B為處理12小時后細胞)圖4為抗腫瘤多肽PI5931處理BEL-7402癌細胞，DAPI染色，觀察凋亡小體的出現。(其中1.正常細胞2.PI5931處理12小時3、PI5931處理18小時，4.PI5931處理24小時(可清晰看見凋亡小體))圖5為抗腫瘤多肽PI5931處理BEL-7402癌細胞，AO/EB染色觀察凋亡細胞細胞核顏色變化圖。具體實施方式實施例1玻璃海鞘多肽的制備方法：1)丙酮沉淀制備粗提物：取新鮮海鞘洗凈、粉碎、分散勻漿機勻漿，在70℃下加熱30min，而后以10000rpm，離心20min，得上清，上清液中加入清液體積三倍的體積百分含量為70％的丙酮，在4℃靜置過夜；靜置過夜后以1000rpm離心20min，取沉淀。沉淀重新溶解后通過5KDa的濾膜進行超濾截留，保留大于5KDa的部分，待用。2)DEAESepharoseTMFastFlow陰離子交換柱層析：首先，將粗提物裝入分子截留量為3.5kD的透析袋，采用純水進行初步透析，而后將其對起始緩沖溶液充分透析；將透析好的樣品取出，10000rpm離心去除不溶物，準備上柱；起始緩沖溶液為0.02MTris-Cl，pH8.0。其次，取適量的DEAESepharoseTMFastFlow填料(GE公司生產)，加入超純水中，用玻璃棒輕微攪拌均勻后，玻璃棒引流，裝入16×26規格的層析柱，用起始緩沖溶液平衡3-4個柱體積，基線穩定后方可使用。再次，將樣品上柱后，用起始緩沖溶液沖洗，待不掛柱蛋白完全穿透后，開始洗脫，洗脫液為Tris-Cl、NaCl溶液，即在起始緩沖液的基礎上，分別配制0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.3M和0.5MNaCl溶液，而后進行分步洗脫，流速為5ml/分鐘，整個層析過程采用280nm檢測蛋白質洗脫峰。最后，將由六個不同濃度濃度NaCl洗脫所得到的組分用純水充分透析后凍本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于：玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。

【技術特征摘要】
1.一種玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于：玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。2.按權利要求1所述的玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于：所述玻璃海鞘多肽在制備抗人肺癌細胞、人宮頸癌上皮細胞、人肝癌細胞、人結腸癌細胞、人乳腺癌細胞和人神經膠質瘤細胞藥物中的應用。3.按權利要求1所述的玻璃海鞘多肽的應用，其特征在于：所述玻璃海鞘多肽按如下步驟制備，1)將新鮮的海鞘通過60％-80％有機溶劑丙酮以4-20℃進行沉淀提取1-3次，沉淀物通過濾膜進行超濾截留大于5KDa物質，待用；2)將上述截留大于5KDa物質，以0.05-0.5M的NaCl緩沖液作為洗脫液進行DEAE陰離子交換柱層析，收集0.15MNaCl緩沖液洗脫組分，待用；3)將上述收集的洗脫組分經Superdex75分子篩凝膠層析，用超純水做洗脫液，流速為0.8-1.2ml/min，收集洗脫組分，待用；4)將上...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張恒，
申請(專利權)人：威海恒基偉業信息科技發展有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37