I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法技術

本發明專利技術提供了一種鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，首先分別選取鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒中高度保守的基因為目標片段I和目標片段Ⅱ，設計并合成相應的特異性引物I和特異性引物Ⅱ；然后分別對鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的基因組RNA和DNA進行提取，將其混合作為模板，進行二重PCR擴增；最后用瓊脂糖凝膠電泳對得到的二重PCR產物進行分析。本發明專利技術提供的鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法操作簡單、省時省力，可以在同一個反應體系中進行PCR和RT?PCR，同時對DNA病毒(鴨瘟病毒)和RNA病毒(鴨肝炎病毒)進行擴增和檢測，大大減少分別檢測所花費的時間和人力成本；本方法具有良好的特異性，能夠擴增出高度特異的片段，并且產物雜質極少，適合推廣使用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學
，特別涉及一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法。
技術介紹
鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV)引起的一種在雛鴨間傳播迅速和高度致死性的傳染病，主要特征為肝臟腫大，有出血斑點和神經癥狀，在新疫區，本病致死率很高，可達90％以上。鴨肝炎病毒I型屬于小RNA病毒科，呈球形或類球形，直徑在20-40NM，無囊膜，無血凝性，可在鴨、雞、鵝胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力強，在自然環境中可較長時間存活。DHV病毒II型屬于星狀病毒，DHV病毒III型屬于小RNA病毒。DVH病毒三種血清型之間無交叉保護作用。目前在我國鴨肝炎病毒I型是主要的流行血清型。鴨瘟又名鴨病毒性腸炎，是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病可引起7日齡以上的雛鴨發病。該病的特征是流行廣泛，傳播迅速，發病率和死亡率極高。引起鴨瘟的病原體鴨瘟病毒(DPV)屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)皰疹病毒屬(Herpesvirus)中的濾過性的病毒，病毒粒子呈球形，直徑為120～180nm，有囊膜，病毒核酸型為DNA。病毒在病鴨體內分散于各種內臟器官、血液、分泌物和排泄物中，其中以肝、肺、腦含毒量最高。本病毒對禽類和哺乳動物的紅細胞沒有凝集現象，毒株間在毒力上有差異，但免疫原性相似。I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒是危害養鴨業的兩種重要病原，引起雛鴨混合感染，導致大批雛鴨染病死亡，造成嚴重的損失。目前對這兩種病毒通常需要分別進行檢測，費時費力，成本較高。多重PCR(multiplexPCR)又稱多重引物PCR或復合PCR，是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，可用于同時鑒定多種微生物。授權公告號為CN104450939B的專利技術專利公開了一種粉大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速檢測方法，可同時對粉蕉枯萎病和大蕉枯萎病的病菌進行檢測。靈敏度高、方便快捷、省時省力。因此，如果能開發出一種同時檢測I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的方法，將會大大節約人力和時間成本。
技術實現思路
為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法。本專利技術具體技術方案如下：本專利技術提供了一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括如下步驟：(1)選取I型鴨肝炎病毒中高度保守的基因為目標片段I，設計并合成相應的特異性引物對I，所述特異性引物對I的序列如下：上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT3'(如SEQIDNO.1所示)；下游引物P2：5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA3'(如SEQIDNO.2所示)；(2)選取鴨瘟病毒中高度保守的基因為目標片段Ⅱ，設計并合成相應的特異性引物對Ⅱ，所述特異性引物對Ⅱ的序列如下：上游引物P3：5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC3'(如SEQIDNO.3所示)；下游引物P4：5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT3'(如SEQIDNO.4所示)；(3)分別對I型鴨肝炎病毒的基因組RNA和鴨瘟病毒的基因組DNA進行提取；(4)將步驟(3)中得到的DNA和RNA混合作為模板，聯合使用特異性引物I和特異性引物Ⅱ進行二重PCR擴增；(5)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(4)中得到的二重PCR產物進行分析。上述方法可以同時對DNA病毒(鴨瘟病毒)和RNA病毒(I型鴨肝炎病毒)進行擴增和檢測，從一套實驗中同時得到兩份結果，大大減少分別檢測所花費的時間和人力成本；特異性引物對I和特異性引物對Ⅱ均具有良好的特異性，能夠擴增出高度特異的片段，并且雜質極少，也為后續的鑒定操作提供了便利。進一步地，所述二重PCR的反應體系中包括如下組分：I型鴨肝炎病毒基因組RNA≥2.65ng/mL、鴨瘟病毒基因組DNA≥1.35ng/mL、特異性引物對I0.15～0.4μM、特異性引物對Ⅱ0.15～0.4μM、dNTP0.4mM、M-MLV1U/μL、RNA酶抑制劑2U/μL、DNA聚合酶0.05U/μL以及體積份數為10～30％的10×PCR反應液。進一步地，所述反應體系中所述特異性引物對I和所述特異性引物對Ⅱ的濃度均為0.35μM。進一步地，所述反應體系中所述I型鴨肝炎病毒基因組RNA的濃度為2.65*10-3～2.65μg/mL，所述鴨瘟病毒基因組DNA的濃度為1.35*10-3～1.35μg/mL。進一步地，所述二重PCR的反應條件如下：45℃保持30min，94℃保持2min；94℃變性1min，54～60℃退火1min，72℃延伸40s，共40個循環；循環結束后72℃延伸10min，最后4℃終止反應。上述反應體系和反應條件均經過優化，使用其對I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒同時進行PCR擴增，可以在同一條件下、一次實驗中同時獲得兩種獲得產量較高、特異性好、純度高的產物，操作簡單、省時省力；RNA酶抑制劑可以抑制環境中存在的微量RNA酶的活性，防止模板RNA被降解，有助于后續實驗的順利進行。進一步地，所述目的片段I的長度為399bp，所述目的片段Ⅱ的長度為232bp。本專利技術的有益效果是：本專利技術提供的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法操作簡單、省時省力，可以在同一個反應體系中進行PCR和RT-PCR，同時對DNA病毒(鴨瘟病毒)和RNA病毒(I型鴨肝炎病毒)進行擴增和檢測，從一套實驗中同時得到兩份結果，大大減少分別檢測所花費的時間和人力成本；根據I型鴨肝炎病毒RNA和鴨瘟病毒DNA的保守序列設計的特異性引物對I和特異性引物對Ⅱ均具有良好的特異性，能夠擴增出高度特異的片段，并且產物雜質極少，適合推廣使用。附圖說明圖1為不同引物用量的二重PCR擴增電泳圖；其中：M:DL2000DNAMarker；1:0.3μL；2:0.4μL；3:0.5μL；4:0.6μL；5:0.7μL；6:0.8μL；圖2為不同退火溫度的二重PCR擴增電泳圖；其中：M:DL2000DNAMarker；1:54℃；2:55℃；3:56℃；4:57℃；5:58℃；6:59℃；7:60℃；圖3為不同模板濃度的二重PCR擴增電泳圖；其中：M：DL2000DNAMarker；1:2.65μg/mLDHV+1.35μg/mLDEV；2:0.265μg/mLDHV+0.135μg/mLDEV；3:26.5ng/mLDHV+13.5ng/mLDEV；4:2.65ng/mLDHV+1.35ng/mLDEV；5:0.265ng/mLDHV+0.135ng/mLDEV；6:26.5pg/mLDHV+13.5pg/mL；圖4為不同病毒種類的二重PCR擴增電泳圖；其中：M：DL2000DNAMarker；1.DHV+DEV；2.DHV；3.DEV；4.AIV；5.ARV；6.AEV；7.EDSV；8.GPV；9.MDPV；10.NDV；11.DTMUV。具體實施方式實施例1一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，包括如下步驟：(1)選取I型鴨肝炎病毒中高度保守的基因為目標片段I，設計并合成相應的特異性引物對I，所述特異性引物對I的序列如下：上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGG本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)選取I型鴨肝炎病毒中高度保守的基因為目的片段I，設計并合成相應的特異性引物對I，所述特異性引物對I的序列如下：上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT?3'；下游引物P2：5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA?3'；(2)選取鴨瘟病毒中高度保守的基因為目的片段Ⅱ，設計并合成相應的特異性引物對Ⅱ，所述特異性引物Ⅱ的序列如下：上游引物P3：5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC?3'；下游引物P4：5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT?3'；(3)分別對I型鴨肝炎病毒的基因組RNA和鴨瘟病毒的基因組DNA進行提?。?4)將步驟(3)中得到的DNA和RNA混合作為模板，聯合使用特異性引物對I和特異性引物對Ⅱ進行二重PCR擴增；(5)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(4)中得到的二重PCR產物進行分析。

【技術特征摘要】
1.一種I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)選取I型鴨肝炎病毒中高度保守的基因為目的片段I，設計并合成相應的特異性引物對I，所述特異性引物對I的序列如下：上游引物P1：5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT3'；下游引物P2：5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA3'；(2)選取鴨瘟病毒中高度保守的基因為目的片段Ⅱ，設計并合成相應的特異性引物對Ⅱ，所述特異性引物Ⅱ的序列如下：上游引物P3：5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC3'；下游引物P4：5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT3'；(3)分別對I型鴨肝炎病毒的基因組RNA和鴨瘟病毒的基因組DNA進行提??；(4)將步驟(3)中得到的DNA和RNA混合作為模板，聯合使用特異性引物對I和特異性引物對Ⅱ進行二重PCR擴增；(5)用瓊脂糖凝膠電泳對步驟(4)中得到的二重PCR產物進行分析。2.如權利要求1所述的I型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒一步法PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中二重PCR的反應體系中包括如下組分：I型鴨肝炎病毒基因組RNA≥2.65ng/mL、鴨瘟病毒基因組DNA≥1.35ng/mL、特異性...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙麗麗，陳洪巖，韓凌霞，張圓圓，陸濤峰，
申請(專利權)人：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：黑龍江;23