檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的通用PCR引物、方法及檢測(cè)試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的通用PCR引物、方法及檢測(cè)試劑盒。該P(yáng)CR引物包括上游引物5’?TGYTCGTTGTGGATSGTGAA?3’和下游引物5’?CTTYGTKKTGGGNTGGTCG?3’。該檢測(cè)試劑盒包含了上述PCR引物。本發(fā)明專利技術(shù)的整體思路為：樣本總DNA的提取、使用通用引物擴(kuò)增目標(biāo)片段、凝膠電泳分析、結(jié)果判定。試驗(yàn)證明本申請(qǐng)適用于副雞禽桿菌快速檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便，通用性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高，成本低，可以同時(shí)進(jìn)行大批量樣本分析的特點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，具體涉及一種采用多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)Ⅰ群禽腺病毒進(jìn)行快速檢測(cè)的通用PCR引物、通用PCR方法及檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)介紹
禽腺病毒(Fowladenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，病毒粒子無囊膜，直徑約70-90nm，呈十二面體對(duì)稱，由衣殼、纖突、核酸芯髓及相關(guān)蛋白構(gòu)成。基因組為單分子、線狀、雙鏈DNA，大小不一，在26kb-45kb之間。根據(jù)群特異性抗原的不同，禽腺病毒可分為3群：I群、Ⅱ群和Ⅲ群。其中I群禽腺病毒包括從雞、火雞、鵝及其它禽類分離獲得的腺病毒，其包含12個(gè)血清型(1-11，8a，8b)和5個(gè)基因型(A-E)，各血清型之間有一定交叉保護(hù)。病毒可經(jīng)糞便、氣管和鼻腔粘膜水平傳播，也可發(fā)生垂直傳播，主要為種雞產(chǎn)蛋期感染后1～2周內(nèi)經(jīng)蛋傳播。雞群感染后表現(xiàn)為包涵體肝炎和心包積液的臨床癥狀，引起死亡率在10％-80％之間，近年來國(guó)內(nèi)報(bào)道此病毒感染有增多的趨勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上沒有商品化的疫苗，增加了FAdV-I的預(yù)防和控制的難度。FAdV-I的診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。病毒的分離與鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可信，但是檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，不利于疾病的快速診斷。生物技術(shù)的飛速發(fā)展極大地推動(dòng)了生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，疾病的診斷、病原的檢測(cè)已從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平。禽腺病毒分子結(jié)構(gòu)與基因序列分析的日益深入為其特異性診斷技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)不同基因型毒株存在的分子結(jié)構(gòu)差異，相繼建立了特異、快速的分子診斷技術(shù)，包括核酸探針技術(shù)、限制性核酸內(nèi)切酶分析和基因片段的體外擴(kuò)增技術(shù)等。這些技術(shù)不僅應(yīng)用于FAdV的檢測(cè)、鑒定和特性研究，還可以追蹤病毒的來源及流行情況。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外擴(kuò)增特異性基因片段的技術(shù)，在疾病的檢測(cè)方面有著廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。PCR能夠選擇性地將病毒基因組的一個(gè)特異性短片段放大10萬倍以上，極大地增強(qiáng)了檢測(cè)的敏感性。PCR方法的建立極大地提高了疾病的診斷速度，對(duì)病毒的流行病學(xué)調(diào)查具有重要的應(yīng)用價(jià)值。大量研究結(jié)果證明，利用特異性引物對(duì)FAdV-I進(jìn)行PCR擴(kuò)增不失為一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。公開于該
技術(shù)介紹
部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本專利技術(shù)的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的通用PCR引物，以及使用了該引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，通用性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高，成本低，可以同時(shí)進(jìn)行大批量樣本分析。為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供了一對(duì)檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的PCR引物，包括上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’(如序列表SEQIDNo.1所示)和下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’(如序列表SEQIDNo.2所示)，其中：上游引物中和下游引物中的Y、S、K和N均為簡(jiǎn)并引物，Y＝C/T，S＝G/C，K＝G/T，N＝A/T/C/G。本專利技術(shù)還提供了一種包含上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’和下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’的檢測(cè)試劑盒。本專利技術(shù)還提供了一種檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系，包括以下組分：其中：上游引物為5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’，下游引物為5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’。20μM的上下游引物是指引物自身的濃度，而非其在PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中的終濃度。在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃45s，55℃45s，72℃35s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述樣本取自待測(cè)菌懸液或禽類臨床病料，如：雞、火雞、鵝或其他禽類的臨床病料。在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，當(dāng)樣本取自禽類臨床病料時(shí)，樣本總DNA提取前還包括樣本預(yù)處理的步驟，所述樣本預(yù)處理的方式為：取臟器組織樣本，將樣本在滅菌生理鹽水中研磨均勻并混懸，離心取上清。本專利技術(shù)還提供了一種檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的PCR方法，包括如下步驟：1)樣本總DNA的提取；2)利用上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’和下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’，對(duì)步驟1)所得的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)分析步驟2)所得PCR產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物包含565bp的片段，則樣本為Ⅰ群禽腺病毒檢測(cè)陽性，否則為檢測(cè)陰性。即：需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶即為565bp的片段。本專利技術(shù)以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中FAdV-D分離株HBQ12(GenBank登錄號(hào)為KM096545)基因組序列作為參考，參照GenBank登錄的檢測(cè)不同基因型FAdV-IDNApolymerase基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)和篩選特異性檢測(cè)引物。通過新型引物，擴(kuò)增FAdV-I的DNApolymerase基因中的保守區(qū)序列長(zhǎng)度約565bp的核苷酸序列，上游引物對(duì)應(yīng)于DNApolymerase基因的7631bp-7650bp之間，下游引物對(duì)應(yīng)于DNApolymerase基因的8177bp-8194bp之間。整體思路為：提取樣本總DNA，利用本申請(qǐng)引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，采用下列反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃5min；32個(gè)循環(huán)(94℃45s，55℃45s，72℃35s)，最后經(jīng)過72℃10min延伸，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，利用紫外凝膠成像儀檢測(cè)目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為FAdV-I檢測(cè)陽性，否則為陰性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果：1)擴(kuò)增的目的片段位于FAdV-I的DNApolymerase基因的高度保守區(qū)，且核苷酸序列為565bp，敏感性好、操作方便、對(duì)不同基因型的FAdV-I均有較好檢出，即通用性好；2)將FAdV-I病毒樣本DNA進(jìn)行10倍系列稀釋后，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行10000倍稀釋后利用本方法仍能檢測(cè)到FAdV-I特異性條帶，表明使用本申請(qǐng)引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒具有較高的靈敏度；3)使用本申請(qǐng)引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒對(duì)其它常見禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒的檢測(cè)結(jié)果皆為陰性，沒有交叉反應(yīng)，表明使用本申請(qǐng)引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒亦具有良好的特異性；4)使用本申請(qǐng)引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒適用于養(yǎng)禽生產(chǎn)中進(jìn)行FAdV-I的檢測(cè)，具有高特異性、高靈敏度、高效率、低成本的特點(diǎn)，可在4h內(nèi)對(duì)臨床病料進(jìn)行快速鑒別診斷，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法通過絨毛尿囊膜途徑接種于10-11日齡SPF雞胚，觀察雞胚絨毛尿囊膜是否增厚、出現(xiàn)痘斑，以及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、包涵體觀察耗本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一對(duì)檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的引物，其特征在于，包括：上游引物5’?TGYTCGTTGTGGATSGTGAA?3’；以及下游引物5’?CTTYGTKKTGGGNTGGTCG?3’。

【技術(shù)特征摘要】
1.一對(duì)檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒的引物，其特征在于，包括：上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’；以及下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’。2.一種包含權(quán)利要求1所述引物的檢測(cè)試劑盒。3.一種PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系，其特征在于，包括以下組分：4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃45s，55℃45s，72℃35s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述反應(yīng)體系，其特征在于，所述樣本取自待測(cè)菌懸液或禽類臨床病料，優(yōu)選雞、火雞、鵝的臨床病料。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述反應(yīng)體系，其特征在于，當(dāng)樣本取自禽類臨床病料時(shí)，樣本總DNA提取前還包括樣本預(yù)處理的步驟，所述樣本預(yù)處理的方式為：取臟器組織樣本，將樣本在滅菌生理鹽水中研磨均勻并混懸，離心取上清...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張國(guó)中，趙靜，馮金玲，徐美玉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11