殺蟲融合蛋白改進制造技術

增加毒素的生物活性的方法。通過將前區域(pro?region)結合到用于產生殺蟲劑毒素的核酸構建體中增加所述毒素的生物活性的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
本專利技術涉及增加重組毒素的生物活性的方法。本專利技術還涉及含有前區域(pro-region)和毒素(尤其是節肢動物毒素)的序列的核酸構建體。專利技術背景針對不斷增加的全球人口的背景，對變得越來越有效的食物生產系統的壓力不斷增加。盡管采取作物保護方面的進展，有害生物仍然是作物生產的主要限制。對最主要六種作物在世界范圍內的可能損失的估計在25-80％之間變化(對于土豆40％)。一些有害生物和疾病可以通過施用農用化學品防治。然而，盡管在市場上可獲得多種殺蟲劑，植物病害仍是主要問題。在過去，大多數開發殺蟲劑的研究集中于鑒別能夠用于該目的的化學實體。然而，這些非靶特異的殺蟲劑常常導致環境破壞，并且對非靶向物種(包括動物物種)和人健康具有消極影響。因此，已經批準禁止將某些化學化合物用于殺蟲劑的歐盟立法。因此，已經向鑒別可以用于有害生物控制的新類型的“生物殺蟲劑”轉變。生物殺蟲劑通常被認為是天然存在的物質(生化殺蟲劑)，能夠防治有害生物的微生物(微生物殺蟲劑)和含有添加的遺傳物質的植物生產的殺蟲物質(植物結合的防護劑)。希望該開發生物殺蟲劑的驅動力將導致用于預防植物病害的更環境友好的選擇。由蜘蛛和其他節肢動物作為毒液合成的神經肽毒素已經是用于作為生物殺蟲劑開發的研究的主題。WO2006/052806、WO2005/025313和US2007/0066529描述了蜘蛛毒素毒液肽用作生物殺蟲劑的用途，并且Khan等人，2006描述了在植物中表達蜘蛛毒液毒素以保護植物免受昆蟲攻擊。本專利技術人之前表明，ω-ACTX-Hv1a，一種源自藍山漏斗網蜘蛛(Hadroncyheversuta)的毒素，當融合能夠介導融合蛋白自無脊椎動物消化道(gut)的移位的蛋白如雪花蓮凝集素“載體”GNA時，可以用作針對寬范圍有害生物的有效殺蟲劑(WO2012/131302)。專利技術概述本專利技術部分基于本專利技術人對在用于表達重組毒素的構建體中包含前區域對所述重組毒素的生物活性的影響的研究。本研究者希望確定可以如何提高體外表達的重組毒素蛋白的生物活性。為了研究這一點，本專利技術人分析了編碼節肢動物毒素的基因的DNA序列。在WO2012/131302中使用的節肢動物毒素是小的、富含半胱氨酸的蛋白，其屬于蛋白序列的幾個超家族(其包括來自除了節肢動物之外的生物的毒素)。所述編碼基因包括兩種在最終蛋白產物中不存在的序列；在翻譯期間移除的預測的N-端信號肽和在信號肽和如分離的蛋白的最終序列之間的預測的前區域(參見圖1A)。前區域是節肢動物和其他生物中的小肽毒素的常見特征(Windley等人，2012)。本專利技術人出人意料地發現在用于表達重組毒素的構建體中包含該預測的前區域導致比由缺少前區域的構建體制備的毒素更好的生物活性。此外，與由缺少前序列的構建體制備的毒素相比，在用于表達在基因組DNA序列中并不天然含有前序列的毒素(例如δ-amaurobitoxin-PI1a)的構建體中包含前序列同樣導致增加的生物活性。因此，在本專利技術的第一方面，提供增加重組毒素的生物活性的方法，所述方法包括：提供核酸構建體，所述核酸構建體包含：(i)毒素序列或其片段或變體，所述毒素序列或其片段或變體連接于(ii)前區域或其片段或變體；和任選地表達重組毒素。在本專利技術的第二方面，提供核酸構建體，其包含：(i)前區域或其片段或變體；和(ii)與所述前區域相鄰的位點，其中可以插入毒素基因序列或其片段或變體。在根據本專利技術的第二方面的實施方案中，所述核酸構建體還包含插入在與所述前區域相鄰的位點中的毒素基因序列或其片段或變體。在本專利技術的第三方面中，提供宿主細胞，其包含根據本專利技術的第二方面的其中插入有毒素基因序列的核酸構建體或其任意實施方案。在本專利技術的第四方面中，提供制備具有增加的生物活性的重組毒素的方法，所述方法包括在適于表達重組毒素的條件下培養本專利技術的第三方面中所述的宿主細胞。根據本專利技術的上述方面的毒素是殺蟲劑毒素。在本專利技術的優選的實施方案中，毒素可以源自節肢動物、軟體動物或其他無脊椎動物。在本專利技術的一個實施方案中，所述毒素是節肢動物毒素。本專利技術的節肢動物毒素可以包括來自藍山漏斗網蜘蛛(Hadronycheversuta)的ω-ACTX-Hv1a和κ-ACTX-Hv1c、來自陰暗擬隙蛛(Pireneitegaluctuosus)的δ-amaurobitoxin-PI1a、管道網型蜘蛛(Segestriaflorentina)毒素Sfl1-8、印度紅蝎(Buthusmesotamulus)毒素ButaIT、來自Eucratoscelusconstrictus的theraphotoxinEc2a、來自Apomastusschlingeri的cyrtoautoxinAs1a、來自Loxoscelesintermedia的sicaritoxinLi1a，和其他類似毒素。根據本專利技術的毒素可以包含20-100個氨基酸殘基的肽。所述毒素可以含有多個半胱氨酸殘基，其形成內部二硫鍵。在一個實施方案中，所述毒素是ω-ACTX-Hv1a或其片段或變體。ω-ACTX-Hv1a毒素是本領域中已知的(Fletcher等人，1997)。其是分離自藍山漏斗網蜘蛛(Hadroncyheversuta)的毒素。ω-ACTX-Hv1a的氨基酸序列是已知的，編碼ω-ACTX-Hv1a的核酸序列也是已知的。ω-ACTX-Hv1a毒素是鈣通道拮抗劑，其之前已被證明阻斷無脊椎動物鈣通道，但不阻斷脊椎動物鈣通道。在多數情況下，希望使用對脊椎動物沒有活性的殺蟲劑，從而避免對人或動物的有害作用。之前報道ω-ACTX-Hv1a在局部用于毛蟲時其本身可以用作殺蟲劑(Khan等人，2006)。然而，上述文獻的作者報道的是所述肽在含有已知自身具有殺昆蟲性的咪唑的溶液中的局部應用。此外，未報道單獨的所述肽的殺昆蟲活性的進一步證據，其他涉及ω-ACTX-Hv1a的公開僅述及通過注射入無脊椎動物有害動物的活性。本專利技術人之前已經證明，重組ω-ACTX-Hv1a的生物活性可以通過產生融合蛋白來提高，其中毒素ω-ACTX-Hv1a與能夠介導融合蛋白自無脊椎動物消化道的移位的“載體”肽融合(WO2012/131302)。本專利技術人使用植物凝集素GNA作為這樣的載體肽的實例。為了研究可以如何另外地提高重組毒素融合蛋白的生物活性，本專利技術人分析了編碼節肢動物毒素尤其是ω-ACTX-Hv1a的基因的DNA序列。發現很多節肢動物基因含有不存在于最終蛋白中的預測的前區域，其之前未被結合到用于體外表達融合蛋白的構建體中。如可從本文看出的，本專利技術人將前區域的序列結合到用于制備重組毒素蛋白的核酸構建體中。本專利技術人發現，與由未修飾的構建體(即含有ω-ACTX-Hv1a序列而沒有另外的前區域)制備重組ω-ACTX-Hv1a相比，通過注射或在包含在膳食中的情況下施用于多種無脊椎有害生物的由含有前區域的構建體制備的重組ω-ACTX-Hv1a導致增加的癱瘓和死亡。因此，當以此形式提供時，ω-ACTX-Hv1a肽毒素可以非常有效地作為針對無脊椎動物的殺蟲劑。如本文使用的，并且如下文進一步說明的，“殺蟲劑”是指針對任何有害生物使用的化學物質、生物劑(如病毒或細菌)、抗微生物劑、消毒劑或裝置。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
增加重組毒素的生物活性的方法，所述方法包括：提供核酸構建體，所述核酸構建體包含：(i)毒素序列或其片段或變體，所述毒素序列或其片段或變體與(ii)連接，(ii)前區域或其片段或變體；和任選地表達所述重組毒素。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.12.11 GB 1321938.11.增加重組毒素的生物活性的方法，所述方法包括：提供核酸構建體，所述核酸構建體包含：(i)毒素序列或其片段或變體，所述毒素序列或其片段或變體與(ii)連接，(ii)前區域或其片段或變體；和任選地表達所述重組毒素。2.核酸構建體，其包含：(i)前區域或其片段或變體；和(ii)與所述前區域相鄰的位點，在所述位點中可以插入毒素基因序列或其片段或變體。3.根據權利要求2所述的核酸構建體，其還包含插入在與所述前區域相鄰的位點中的所述毒素基因序列或其片段或變體。4.宿主細胞，其包含根據權利要求3所述的核酸構建體。5.根據權利要求4所述的宿主細胞，其中所述細胞是酵母巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。6.制備具有增加的生物活性的重組毒素的方法，所述方法包括在適于表達所述重組毒素的條件下培養根據權利要求4或5所述的宿主細胞。7.根據權利要求1或3-6中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述毒素是殺蟲劑毒素。8.根據權利要求1或3-7中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述毒素源自節肢動物、軟體動物或其他無脊椎動物。9.根據權利要求1或3-8中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述毒素是節肢動物毒素，任選地，來自藍山漏斗網蜘蛛(Hadronycheversuta)的ω-ACTX-Hv1a或κ-ACTX-Hv1c、來自陰暗擬隙蛛(Pireneitegaluctuosus)的δ-amaurobitoxin-PI1a、管道網型蜘蛛(Segestriaflorentina)毒素Sfl1-8、印度紅蝎(Buthusmesotamulus)毒素ButaIT、來自Eucratoscelusconstrictus的theraphotoxinEc2a、來自Apomastusschlingeri的cyrtoautoxinAs1a或來自Loxoscelesintermedia的sicaritoxinLi1a。10.根據權利要求1或3-9中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述毒素包含20-100個氨基酸殘基的肽。11.根據權利要求1或3-10中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述毒素是ω-ACTX-Hv1a或其片段或變體。12.根據權利要求1或3-10中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述毒素是δ-amaurobitoxin-PI1a或其片段或變體。13.根據任一在前權利要求所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述前區域是信號肽序列和成熟蛋白N-末端之間的序列，任選地其中所述前區域能夠通過以下步驟鑒別：將針對從其正常來源分離的蛋白所確定的序列與由編碼其的基因預測的序列相比較；鑒別不存在于最終蛋白產物中的N-端序列；鑒別不存在于最終蛋白產物中的N-端序列中的信號肽序列；和任選地通過從所述不存在于最終蛋白產物中的N-端序列移除所述信號肽序列，鑒別在所述信號肽序列和所述成熟蛋白N-末端之間的前區域序列。14.根據任一在前權利要求所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述前區域富含酸性氨基酸殘基。15.根據權利要求1、3-11、13或14中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中在其天然存在的序列中所述毒素與所述前區域結合。16.根據權利要求1或3-14中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中在其天然存在的序列中所述毒素不與所述前區域結合。17.根據任一在前權利要求所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述前區域包含氨基酸序列EDTRADLQGGEAAEKVFRR或其片段或變體。18.根據權利要求1至16中任一項所述的方法、核酸構建體或宿主細胞，其中所述前區域包含氨基酸序列ISYEEGKELFQKER或其片段或變體。19.根...

【專利技術屬性】
技術研發人員：伊萊恩·夏洛特·費奇斯，約翰·亞瑟·蓋特豪斯，普拉香特·希瓦沙蘭·皮亞蒂，楊勝，
申請(專利權)人：達勒姆大學，英國環境，食物及農村事務國務大臣，
類型：發明
國別省市：英國;GB