本發明專利技術涉及一種抑制淀粉樣β蛋白(Aβ)聚集的雙功能短肽抑制劑及其應用。首先從Aβ的經典抑制劑LPFFD序列出發理性設計了雙功能短肽抑制劑LVFFARKHH，然后通過多種實驗手段證明該雙功能短肽抑制劑與Aβ40摩爾濃度比在1:1時，對Aβ40聚集及其相關細胞毒性具備最佳抑制效果：能有效地抑制Aβ40纖維生成；可顯著地抑制Cu2+介導的Aβ40聚集；改變Aβ40聚集路徑，造成Aβ40纖維形貌的變化；可極大的降低Aβ?Cu2+絡合體催化產生氧化自由基·OH的速率；最終大幅度降低Cu2+存在下Aβ40聚集產生的細胞毒性作用。該雙功能短肽抑制劑提供了用于阿爾茲海默癥的原料藥和保健品開發方面的用途。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種雙功能短肽抑制劑(Ac-LVFFARKHH-NH2)及其對Cu2+介導的淀粉樣β蛋白的聚集、氧化自由基粒子產生率和細胞毒性的有效抑制作用，以及其潛在的藥物和保健品開發方面的用途。
技術介紹
阿爾茲海默癥(Alzheimer’sDisease,AD)是一種淀粉樣變病，該病癥起病隱匿，在進行性發展中造成神經系統的退行性病變，是老年癡呆癥最主要的發病形式。AD發病的主要原因之一是淀粉樣β蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的大量產生和聚集形成纖維，在這個過程中富集吸附多種金屬離子，最終形成老年斑(senileplaque,SP)，對神經元細胞產生較高的毒害作用。Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid-βprecursorprotein,APP)經由β和γ分泌酶切割而形成的含有39-43個氨基酸殘基的多肽。Aβ的兩種主要類型為Aβ40和Aβ42，其中Aβ40含量最為豐富。研究表明Aβ單體在水溶液條件下呈現無規則卷曲結構，在聚集形成纖維的過程中首先通過構象轉變形成富含β-折疊的二級結構，然后通過分子間疏水相互作用、氫鍵、鹽鍵等作用力聚集在一起逐漸形成成熟纖維。在聚集過程中形成的可溶性Aβ寡聚體和原纖維是最具神經毒性的。同時，Aβ還具有絡合金屬離子的能力，在AD患者大腦組織中的老年斑內發現Cu2+、Zn2+、Fe3+、Al3+發生富集，老年斑周圍的腦組織中多種金屬離子濃度升高。其中Aβ-Cu2+絡合體由于能夠促進Aβ聚集和催化產生氧化自由基粒子(radicaloxygenspecies,ROS)，因此會造成神經元細胞氧化壓力的增大，導致細胞死亡。針對Aβ聚集產生有毒聚集體，研究者開發了諸多能夠有效抑制Aβ聚集的抑制劑，如：姜黃素、EGCG、多肽、抗體等以及納米粒子抑制劑。由于Aβ的疏水核心序列對于Aβ的聚集具有重要作用，因此研究者基于此多肽設計開發了一系列具有明顯抑制Aβ聚集效果的多肽抑制劑。但研究表明在體內，Aβ聚集過程中常會伴隨金屬離子的絡合，因此近些年來許多研究者致力于開發雙功能的Aβ聚集抑制分子，使其既能夠螯合金屬離子，又能抑制Aβ聚集。本專利技術是在先前Aβ聚集抑制短肽LVFFARK的基礎上，通過在其C末端添加能夠絡合Cu2+的螯合片段HH設計成的雙功能短肽抑制劑，可以實現抑制Aβ聚集和鰲合金屬離子雙功能，為開發新型藥物提供新的設計思路。
技術實現思路
本專利技術的目的是開發抑制Aβ聚集毒性的新型抑制劑，提出設計合成一種既能夠抑制Aβ40蛋白聚集，降低Aβ40蛋白造成的神經細胞毒性，又能降低Aβ-Cu2+絡合體催化產生ROS速率的一種新的雙功能短肽抑制劑(Ac-LKFFARKHH-NH2)，以及其抑制淀粉樣β蛋白聚集和相關細胞毒性方面的應用。本專利技術的技術方案如下：一種抑制淀粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑；其氨基酸序列為：Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His。本專利技術的抑制淀粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑抑制Cu2+存在下β-淀粉樣蛋白聚集及其相關細胞毒性的應用。應用為雙功能短肽與β-淀粉樣蛋白摩爾濃度比優選為1:1。抑制淀粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑用于阿爾茲海默癥藥物和保健品開發方面的用途。抑制淀粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑用于用于阿爾茲海默癥的藥物的原料藥。本專利技術設計合成的雙功能短肽抑制劑是基于Aβ的疏水核心序列(KLVFFAE)得到的一個九肽，本身具有抑制Aβ聚集的能力；端基乙?；王０坊?，具有降低多肽在血漿中的代謝速度和增強穿透血腦屏障的能力；帶正電荷HH的引入，增大了多肽間的排斥力，不利于多肽自身的聚集，同時可以螯合Cu2+，降低由Aβ-Cu2+絡合體催化產生的ROS對細胞的影響。因此使之成為具有前景的治療AD的候選藥物。本專利技術的優點：多種實驗手段證明，雙功能短肽抑制劑與Aβ40蛋白摩爾濃度比在1:1時，就能夠有效地抑制了Aβ40纖維的生成，并且抑制Aβ-Cu2+絡合體催化產生ROS的速率，最終大幅降低了Aβ40的聚集和絡合金屬Cu2+所帶來的細胞毒性作用，是Aβ40聚集和神經細胞氧化壓力的有效抑制劑。附圖說明圖1：不同濃度的雙功能短肽抑制劑與Aβ40共培養72h后的ThT熒光強度變化；圖2：摩爾濃度比為1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和雙功能短肽抑制劑共培養的ThT熒光動力學；圖3：摩爾濃度比為1:0.4:1的Aβ40、Cu2+和雙功能短肽抑制劑共培養的培養物形貌(圖3C)，其中圖3A為單獨培養Aβ40形成的聚集體的形貌，圖3B為摩爾濃度比為1:0.4的Aβ40和Cu2+共同培養形成的聚集體的形貌。圖4：雙功能短肽抑制劑對Aβ-Cu2+絡合體催化產生·OH生成速率的影響；圖5：Aβ40與Cu2+和雙功能短肽抑制劑按摩爾比1:0.4:1共培養24h后培養物對PC-12細胞存活率的影響。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步的說明。我們通過多種物理化學生物的檢測手段證實雙功能短肽抑制劑可以有效抑制Aβ40聚集和抑制Aβ-Cu2+絡合體催化產生ROS的速率，最終降低Aβ40的聚集和絡合金屬Cu2+所帶來的細胞毒性作用。雙功能短肽抑制劑氨基酸序列：Ac-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His-NH2雙功能短肽抑制劑結構式：實施例1：不同濃度雙功能短肽抑制劑與Aβ40共培養72h后的ThT熒光強度變化首先將儲存于-80℃冰箱的Aβ40置于室溫下，待其溫度升至室溫，稱取Aβ40粉末以1mg/mL的濃度溶于純六氟異丙醇；將此溶液在-4℃下靜置2h，待其完全溶解后超聲2min以打散Aβ40聚集體；將超聲后的Aβ40溶液于4℃，16000g離心20min，取上清的75％；將取出的75％上清液在-80℃冰箱內凍實4h以上，隨后冷凍干燥24h，得到預處理好的蓬松棉絮狀的Aβ40，置于-20℃下保存。溶液配制如下：稱取2.2mgAβ40溶于2mL20mMNaOH溶液中，配制成終濃度為250μM的Aβ母液，冰浴超聲處理20min，使其完全溶解；稱取8mg的ThT溶于1LHEPES緩沖液(20mMHEPES,NaCl100mM，pH＝7.4)中，使其濃度為25μM；稱取0.47mg的雙功能短肽抑制劑溶于200mLDMSO中，使其濃度為2mM。利用HEPES緩沖液進行稀釋，使各實驗組均含有Aβ4025μM，雙功能短肽抑制劑的濃度分別為0μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM。用漩渦混合器混合均勻，將在37℃，150rpm條件下震蕩共培養72h。檢測時用ThT染液將培養液稀釋20倍后，測定ThT熒光強度。以僅含Aβ的樣品為100％，無Aβ與抑制劑的緩沖液為0進行歸一化，繪制ThT熒光強度百分比隨時間的變化曲線，每個實驗點取三次重復實驗的平均值。熒光光度計儀器參數：激發波長440nm(激發帶寬5nm)；發射波長480nm(發射帶寬5nm)。結果如圖1所示。由圖1可知，加入雙功能短肽抑制劑雙功能短肽抑制劑后Aβ40的ThT熒光強度明顯下降，說明雙功能短肽抑制劑能有效抑制Aβ40的聚集。ThT熒光強度下降程度與雙功能短肽抑制劑的濃度呈正比，說明雙功能短肽抑制劑濃度越高，其抑制Aβ40聚集效果越好。實施本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種抑制淀粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑；其特征是氨基酸序列為：Leu?Val?Phe?Phe?Ala?Arg?Lys?His?His。
【技術特征摘要】
1.一種抑制淀粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑；其特征是氨基酸序列為：Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Arg-Lys-His-His。2.權利要求1的抑制淀粉樣β蛋白聚集的雙功能短肽抑制劑抑制Cu2+存在下β-淀...
【專利技術屬性】
技術研發人員：董曉燕，張沖，余林玲，孫彥，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：天津;12
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