一種瓦氏秋海棠的離體再生方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種瓦氏秋海棠的離體再生方法，對瓦氏秋海棠的種子進行萌發(fā)培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，并對培養(yǎng)基進行了研究。本發(fā)明專利技術(shù)結(jié)合瓦氏秋海棠的生長特點，選用了合適的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度，能夠有針對性地誘導瓦氏秋海棠葉片形成不定芽，繼而誘導根的發(fā)育，最終使試管苗能夠發(fā)育成為完整的植株，移栽成活率達到95％以上。利用本發(fā)明專利技術(shù)能快速、高效地繁殖瓦氏秋海棠，為今后更進一步合理利用該物種奠定良好的基礎(chǔ)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種瓦氏秋海棠的離體再生方法。
技術(shù)介紹
瓦氏秋海棠(BegoniawallichianaLehm)為秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠屬(Begonia)多年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲墨西哥等地。瓦氏秋海棠生長速度快，四季均可開花，雌雄同株異花，花白色；同時，其抗性較強，葉表面被生纖毛，不容易滋生病蟲害，是一個潛在的成為模式植物的候選物種，也是一種良好的家庭觀賞植物。但是，瓦氏秋海棠的種子細小，體積僅是擬南芥種子的一半大小，肉眼難辨，單株種植困難，并且，在溫室或自然條件下，瓦氏秋海棠扦插不易成活，無法大量繁殖。目前，還沒有見到瓦氏秋海棠組織培養(yǎng)的相關(guān)報道，因此，需要建立瓦氏秋海棠的離體培養(yǎng)和再生體系的方法，既可用于大量快繁，也為將來進行瓦氏秋海棠的分子育種及秋海棠屬的分子生物學研究建立基礎(chǔ)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種瓦氏秋海棠的離體再生方法，有針對性地誘導瓦氏秋海棠葉片形成不定芽，繼而誘導根的發(fā)育，最終使試管苗能夠發(fā)育成為完整的植株，移栽成活率達到95％以上，繁殖周期約40～60天，增殖系數(shù)約為3～5左右，可以有效地擴繁和再生瓦氏秋海棠。為了達到上述目的，本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案如下：一種瓦氏秋海棠的離體再生方法，包括如下步驟：1)萌發(fā)培養(yǎng)將瓦氏秋海棠種子消毒，然后播種于萌發(fā)培養(yǎng)基上，進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為12～18小時/天，種子生長10～15天后萌發(fā)，形成幼苗，待子葉抽出后，將幼苗分成單株，移苗至萌發(fā)培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)至長出葉片；2)誘導培養(yǎng)將步驟1)的幼葉剪切為面積在0.5～1cm2的葉片，作為外植體，接種于誘導培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)20～30天，誘導產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為12～18小時/天；其中，誘導培養(yǎng)基中含有：MS培養(yǎng)基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝膠3～4g/L，pH調(diào)節(jié)到5.8～6.2；3)生根培養(yǎng)將步驟2)中獲得的不定芽置于生根培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15～20天，獲得瓦氏秋海棠的生根苗；4)移栽將步驟3)獲得的生根苗移栽至栽培基質(zhì)中，覆蓋保鮮膜保濕，在溫室中光照培養(yǎng)3～7天，揭膜，轉(zhuǎn)入自然光下繼續(xù)生長，及時澆水，施肥，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后獲得瓦氏秋海棠栽培苗。進一步，步驟1)中所述的萌發(fā)培養(yǎng)基中包含：1/2MS培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基，蔗糖10～30g/L和植物凝膠3～4g/L，pH為5.8～6.2；步驟3)中生根培養(yǎng)基包含1/2MS，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝膠3～4g/L。又進一步，步驟4)中所述的栽培基質(zhì)為由蛭石：珍珠巖：土按體積比為1：1～2：1～2制成的混合基質(zhì)。優(yōu)選地，步驟1)中對瓦氏秋海棠種子進行消毒的過程為：將瓦氏秋海棠種子用酒精消毒8～10秒鐘，去除酒精，加入次氯酸鈉溶液消毒3～5分鐘，棄去消毒液，再用無菌水洗3～5次。又優(yōu)選地，步驟1)中，將瓦氏秋海棠的種子在消毒后用滅菌的0.1％低熔點瓊脂糖懸浮。本專利技術(shù)提供另一種瓦氏秋海棠的離體再生方法，包括以下步驟：1)誘導培養(yǎng)將野外生長的瓦氏秋海棠葉片剪切為面積在0.5～1cm2的葉片，作為外植體，接種于誘導培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)20～30天，誘導產(chǎn)生不定芽和愈傷組織，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為12～18小時/天；其中，誘導培養(yǎng)基中含有：MS培養(yǎng)基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝膠3～4g/L，pH調(diào)節(jié)到5.8～6.2；2)生根培養(yǎng)將步驟1)中獲得的不定芽插入到生根培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15～20天，獲得瓦氏秋海棠的生根苗；3)移栽將步驟2)獲得的生根苗移栽至栽培基質(zhì)中，覆蓋保鮮膜保濕，在溫室中光照培養(yǎng)3～7天，揭膜，轉(zhuǎn)入自然光下繼續(xù)生長，及時澆水，施肥，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后獲得瓦氏秋海棠栽培苗。進一步，步驟2)中的生根培養(yǎng)基包含1/2MS培養(yǎng)基，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝膠3～4g/L。優(yōu)選地，進行誘導培養(yǎng)時，在將所述的外植體接種至誘導培養(yǎng)基前，先對其進行消毒，利用0.1％HgCl溶液對葉片消毒4～8分鐘。本專利技術(shù)所述的MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，其成分和配制方法參看譚文澄、戴策剛主編《觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)》，北京：中國林業(yè)出版社，1991，1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基中的無機鹽成分含量減半。本專利技術(shù)所述各種培養(yǎng)基中添加的植物凝膠起支撐固定作用，其也可由瓊脂等常用支撐固定材料代替。在離體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑對于細胞脫分化起關(guān)鍵性作用。本專利技術(shù)通過在培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠有目的地誘導瓦氏秋海棠不定芽的形成。由外植體直接誘導不定芽時，不定芽的誘導主要靠細胞分裂素6-BA(即6-芐基氨基嘌呤)和生長素NAA(即α-奈乙酸)的共同作用。現(xiàn)有技術(shù)中，誘導愈傷組織時，生長素類物質(zhì)大多選用2，4-D(即2，4-二氯苯氧乙酸)或者NAA，或者2，4-D和NAA共同使用。但是，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，在瓦氏秋海棠的愈傷組織的誘導過程中，由于基物種差異，選用上述方案時，在不使用細胞分裂素6-BA的情況下，會導致外植體直接死亡；添加細胞分裂素6-BA和生長素NAA時，并不能很好地誘導瓦氏秋海棠不定芽的產(chǎn)生，而在添加6-BA的情況下，當生長素NAA和2,4-D聯(lián)合使用時，愈傷組織的形成和不定芽的產(chǎn)生則容易得多。本專利技術(shù)選擇6-BA，NAA和2，4-D搭配使用，并合理配置其含量，可以很好地誘導不定芽和愈傷的產(chǎn)生，出芽率達到50～65％。經(jīng)過生根，最終使試管苗能夠發(fā)育成為完整的植株，移栽成活率達到95％以上，為今后更進一步利用該物種奠定良好的基礎(chǔ)。本專利技術(shù)在將瓦氏秋海棠的種子在消毒后用滅菌的0.1％低熔點瓊脂糖懸浮，再點播于萌發(fā)培養(yǎng)基上，可以使瓦氏秋海棠的種子均勻地分散在培養(yǎng)基中。瓦氏秋海棠種子細小，此方法可避免種子聚集在一起，從而提高種子萌發(fā)率和便于移栽。本專利技術(shù)的有益效果：本專利技術(shù)結(jié)合瓦氏秋海棠的生長特點，誘導過程中，在培養(yǎng)基中添加了合適含量的6-BA，NAA和2，4-D，能夠有針對性地誘導瓦氏秋海棠的葉片形成不定芽，繼而誘導生根，最終發(fā)育成為完整的植株，移栽成活率達到95％以上。附圖說明圖1為本專利技術(shù)實施例1中在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)的幼苗。圖2為本專利技術(shù)實施例1中培養(yǎng)至長出幼葉的幼苗。圖3為本專利技術(shù)實施例1中接種至誘導培養(yǎng)基上的外植體。圖4為本專利技術(shù)實施例1中外植體在誘導培養(yǎng)基上形成的愈傷組織和不定芽。圖5為本專利技術(shù)實施例1中不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中獲得的生根苗。圖6為本專利技術(shù)實施例1中的生根苗移栽后的瓦氏秋海棠栽培苗。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對本專利技術(shù)作進一步說明。實施例1一種瓦氏秋海棠的離體再生方法，包括如下步驟：1)萌發(fā)培養(yǎng)將瓦氏秋海棠種子消毒，然后用滅菌的0.1％低熔點瓊脂糖懸浮，點播于萌發(fā)培養(yǎng)基上，進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為16小時/天，種子生長10～15天后萌發(fā)(參見圖1)，萌發(fā)率幾乎100％，形成幼苗，當小苗基部有少量根出現(xiàn)時，將幼苗分單株移苗，繼續(xù)在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長出幼葉，直至葉片展開(參見圖本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種瓦氏秋海棠的離體再生方法，包括如下步驟：1)萌發(fā)培養(yǎng)將瓦氏秋海棠種子消毒，然后播種于萌發(fā)培養(yǎng)基上，進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為12～18小時/天，種子生長10～15天后萌發(fā)，形成幼苗，待子葉抽出后，將幼苗分成單株，移苗至萌發(fā)培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)至長出葉片；2)誘導培養(yǎng)將步驟1)的幼葉剪切為面積在0.5～1cm2的葉片，作為外植體，接種于誘導培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)20～30天，誘導產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為12～18小時/天；其中，誘導培養(yǎng)基中含有：MS培養(yǎng)基，6?BA?4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4?D?0.1～0.2mg/L和植物凝膠3～4g/L，pH調(diào)節(jié)到5.8～6.2；3)生根培養(yǎng)將步驟2)中獲得的不定芽置于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15～20天，獲得瓦氏秋海棠的生根苗；4)移栽將步驟3)獲得的生根苗移栽至栽培基質(zhì)中，覆蓋保鮮膜保濕，在溫室中光照培養(yǎng)3～7天后，揭膜，轉(zhuǎn)入自然光下繼續(xù)生長，及時澆水、施肥，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后獲得瓦氏秋海棠栽培苗。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種瓦氏秋海棠的離體再生方法，包括如下步驟：1)萌發(fā)培養(yǎng)將瓦氏秋海棠種子消毒，然后播種于萌發(fā)培養(yǎng)基上，進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為12～18小時/天，種子生長10～15天后萌發(fā)，形成幼苗，待子葉抽出后，將幼苗分成單株，移苗至萌發(fā)培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)至長出葉片；2)誘導培養(yǎng)將步驟1)的幼葉剪切為面積在0.5～1cm2的葉片，作為外植體，接種于誘導培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)20～30天，誘導產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，培養(yǎng)溫度為20～25℃，光照時間為12～18小時/天；其中，誘導培養(yǎng)基中含有：MS培養(yǎng)基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝膠3～4g/L，pH調(diào)節(jié)到5.8～6.2；3)生根培養(yǎng)將步驟2)中獲得的不定芽置于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)15～20天，獲得瓦氏秋海棠的生根苗；4)移栽將步驟3)獲得的生根苗移栽至栽培基質(zhì)中，覆蓋保鮮膜保濕，在溫室中光照培養(yǎng)3～7天后，揭膜，轉(zhuǎn)入自然光下繼續(xù)生長，及時澆水、施肥，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后獲得瓦氏秋海棠栽培苗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瓦氏秋海棠的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1)中所述的萌發(fā)培養(yǎng)基中包含：1/2MS培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基，蔗糖10～30g/L以及植物凝膠3～4g/L，pH為5.8～6.2。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瓦氏秋海棠的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3)中生根培養(yǎng)基包含1/2MS培養(yǎng)基，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝膠3～4g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瓦氏秋海棠的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟4)中所述的栽培基質(zhì)為由蛭石：珍珠巖：土按體積比為1：1～2：1～2制成的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：田代科，張大生，陳青，趙喜雙，付乃峰，劉青青，陳蒙嬌，吳少華，
申請(專利權(quán))人：上海辰山植物園，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31