一種臍帶組織凍存液制造技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，公開了一種臍帶組織凍存液，所述臍帶組織凍存液對臍帶組織具有良好的凍存效果。本發明專利技術公開的凍存液按體積濃度計包括如下組分：二甲基亞砜10～20％；DMEM/F12?65～80％；非必需氨基酸1～5％；右旋糖酐5～20％。本發明專利技術還公開了一種臍帶組織的凍存方法，包括以下步驟：將預處理過的臍帶組織放入含上述的凍存液的凍存管內制成凍存樣品，然后將凍存樣品放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入?80℃冰箱內，24h后將成品轉入液氮中，完成凍存。本發明專利技術還公開了所述臍帶組織凍存液在組織凍存中的應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，特別涉及一種臍帶組織凍存液。
技術介紹
臍帶是胎兒時期連接胎兒與母體胎盤的索狀或管狀結構，其外被羊膜，內含2條臍動脈和1條臍靜脈組成，在動靜脈之間含有特殊的胚胎粘液樣結締組織—華爾通氏膠(WhartonpsJelly)，華爾通氏膠里含有豐富的可分離得到的臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)。臍帶間充質干細胞是一種多功能干細胞，它能分化成許多種組織細胞，具有廣闊的臨床應用前景。但臍帶組織在4℃條件下最多能保存6天，超過48h再進行原代分離培養的臍帶組織得到純的臍帶間充質干細胞的概率會大大減低?，F有的臍帶組織凍存方法雖然提供了基本的凍存液和程序降溫方法，但是未能提供更豐富的營養物質及保護劑，不利于長時間的凍存臍帶組織，限制了其臨床應用。因此，研究一種能長時間凍存臍帶組織的方法是本領域技術人員需要解決的技術問題。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術公開了一種能長時間凍存臍帶組織的凍存液，所述凍存液對臍帶組織具有良好的凍存效果。本專利技術公開了一種凍存液，按體積濃度計，包括如下組分：優選地，所述凍存液按體積濃度計，包括如下組分：作為優選，所述培養基為DMEM、DMEM/12或1640培養基。作為優選，所述右旋糖酐為中分子右旋糖酐、低分子右旋糖酐和小分子右旋糖酐中的任意一種。其中，最優選為中分子右旋糖酐。本專利技術還公開了一種臍帶組織的凍存方法，包括以下步驟：將預處理過的臍帶組織放入含上述凍存液的凍存管內制成凍存樣品，然后將所述凍存樣品放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃冰箱內，24h后將所述凍存樣品轉入液氮中，完成凍存。預處理方法為用生理鹽水將臍帶充分洗滌2次，用組織剪將臍帶兩端剪去，再清洗2次。然后用尖頭剪將臍帶剪成約2cm的小段，清洗2次。將臍帶沿靜脈血管平行方向剪開小口，再用組織鑷縱向撕開、展平；再將3根血管及羊膜從臍帶中剝離干凈，可得臍帶華通氏膠，轉移至離心管中，并剪至1～2mm3小塊。向華通氏膠小塊中加入含10％DMSO+90％培養基的平衡液，使組織塊全部浸沒，置4℃進行濃度平衡15min。平衡后-4℃、1500rpm離心5min，去上清，稱取2g華通氏膠，放入凍存管內進行后續凍存操作。本專利技術還公開了所述凍存液在組織凍存中的應用。對本專利技術公開的凍存液中包括的部分組分介紹如下：二甲基亞砜(DMSO)，是一種含硫有機化合物，分子式為(CH3)2SO，常溫下為無色無臭的透明液體，是一種具有吸濕性的可燃液體，具有高極性、高沸點、熱穩定性好、非質子、與水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多數有機物，被稱為“萬能溶劑”。在酸存在時對DMSO加熱會產生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫和甲磺酸等化合物。DMSO在高溫下有分解現象，遇氫能發生劇烈反應，在空氣中燃燒發出淡藍色火焰。DMSO可用作有機溶劑、反應介質和有機合成中間體，也可用作合成纖維的染色溶劑、去染劑和染色載體，還可用作回收乙炔和二氧化硫的吸收劑。DMSO能快速通過細胞膜進入細胞內部，在細胞冷凍過程中，維持細胞內外的水和離子平衡。非必需氨基酸(MEMNEAA)，包括丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸等。非必需氨基酸可通過人體自身合成或從其它氨基酸轉化得到。有些非必需氨基酸的攝入量還會影響必需氨基酸的需求量，例如，當膳食中的半胱氨酸和酪氨酸充裕時，可分別減少對蛋氨酸和苯丙氨酸的需求。因此，半胱氨酸和酪氨酸又被稱為半必需氨基酸或條件必需氨基酸。非必需氨基酸可在動物體內合成，作為營養源，不需要從外部補充氨基酸。對人來說非必需氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。這些氨基酸由碳水化合物的代謝物或由必需氨基酸合成碳鏈，進一步由氨基轉移反應引入氨基生成氨基酸。已知即使攝取非必需氨基酸，也是對生長有利的。右旋糖酐系蔗糖經腸膜狀明串珠菌-1226(Leuconostocmesenteroides)發酵合成的一種高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血漿代用品之一。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品，用于治療出血性休克、創傷性休克及燒傷性休克等。低、小分子右旋糖酐能改善微循環，預防或消除血管內紅細胞聚集和血栓形成等，亦有擴充血容量的作用，用于治療各種休克所致的微循環障礙、彌漫性血管內凝血、心絞痛、急性心肌梗塞及其他周圍血管疾病等。在本專利技術中，右旋糖酐可以為組織塊的凍存模擬一個接近原始的環境；而臍帶組織離開胎盤后缺乏營養供應，對氨基酸的補充需要完整，包括必需氨基酸和非必需氨基酸的補充，這樣才能保證臍帶組織塊的活性；DMSO能快速通過細胞膜進入細胞內部，在細胞冷凍過程中，維持細胞內外的水和離子平衡，同時可以時保護液中讓各組分間的充分混合以及具有協同增效的作用。用本專利技術實施例制備的凍存液對臍帶組織進行凍存，6個月后將凍存的臍帶組織復蘇并分離得到臍帶間充質干細胞的形態與凍存前進行原代分離得到的臍帶間充質干細胞的形態一致，且相比于傳統的凍存液，用本專利技術實施例制備的凍存液凍存復蘇后的臍帶組織分離得到臍帶間充質干細胞的成功率高，且細胞的免疫表型和分化能力沒有發生變化。綜上所述，本專利技術公開了一種臍帶組織凍存液，該凍存液能為臍帶組織模擬一個接近原始的環境和提供充足的營養物質，對臍帶組織的凍存效果好，能對臍帶組織進行長時間的凍存。從凍存復蘇后的臍帶組織分離得到的臍帶間充質干細胞的細胞形態、免疫表型和分化能力與凍存前相比未發生變化。且該臍帶組織凍存液的成本低，利于大規模推廣應用。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為正常原代分離的臍帶間充質干細胞的顯微鏡圖；圖2為本專利技術實施例制備的凍存液凍存復蘇后原代分離得到的臍帶間充質干細胞的顯微鏡圖；圖3為凍存復蘇后進行分離得到的臍帶間充質干細胞的流式結果圖；圖4為未凍存直接進行原代分離得到的臍帶間充質干細胞的流式結果圖；圖5為臍帶間充質干細胞體外向脂肪細胞誘導分化的顯微鏡染色圖。具體實施方式本專利技術公開了一種臍帶組織凍存液，該凍存液對臍帶組織具有良好的凍存效果。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本專利技術。本專利技術的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
技術實現思路
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本專利技術技術。本專利技術實施例中所使用到的組分或制劑均為市售或自制來源。非必需氨基酸為購自GIBCO公司的100×溶液。下面結合實施例，進一步闡述本專利技術。實施例1配制凍存液在無菌條件下，將上述量的組分混合，用DMEM/F12定容至目標體積，制得2×的凍存液。在實際使用時將2×凍存液稀釋成1×使用。實施例2配制凍存液在無菌條件下，將上述量的組分混合，用DMEM定容至目標體積，制得2×的凍存液。在實際使用時將2×凍存液稀釋成1×使用。實施例3配制凍存液在無菌條件下本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種凍存液，其特征在于，按體積濃度計，包括如下組分：所有組分的體積濃度總和為100％。

【技術特征摘要】
1.一種凍存液，其特征在于，按體積濃度計，包括如下組分：所有組分的體積濃度總和為100％。2.根據權利要求1所述的凍存液，其特征在于，按體積濃度計，包括如下組分：3.根據權利要求1或2所述凍存液，其特征在于，所述培養基為DMEM、DMEM/12或1640培養基。4.根據權利要求1或2所述凍存液，其特征在于，所述右旋糖酐為中分子右旋糖酐、低分子右...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳海佳，葛嘯虎，王一飛，黃幸，王小燕，
申請(專利權)人：廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44