用于塊面成像的微型串行分割切片機制造技術

本公開內容涉及切片機設備的實施方案及其使用方法。在一些實施方案中，切片機可以安裝在掃描電子顯微鏡的內置平臺上并且用于執行串行塊面掃描電子顯微術。在一些情況下，安裝在掃描電子顯微鏡中的切片機可以在離開掃描電子顯微鏡的電子束軸的位置處切割樣品。在一些情況下，切片機可以包括可以測量切片機的刀片的位置的電容傳感器，并且切片機可以通過在MATLAB中實施的程序進行計算機控制。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請的交叉引用本申請要求2014年5月12日提交的美國臨時申請No.61/991,929的權益，所述美國臨時申請以引用的方式并入本文。
本公開內容涉及切片機(microtome)設備及其使用方法，具體來說涉及被設計用于塊面成像應用(包括基于光學或電子的成像)的切片機設備。
技術介紹
塊面成像技術的一種應用是串行塊面掃描電子顯微術(有時被稱為SBEM、SBSEM和/或SBFSEM)，其是指沿著第三維度在連續平面上產生樣品的多個二維圖像，由此產生關于樣品的三維結構的數據的過程。SBSEM技術可以用于研究許多不同類型的生物標本，并且經常用于研究腦組織。其特別用于收集高分辨率的解剖數據，例如當映射大腦中的軸突和神經元回路連接時。一個SBSEM過程包括使用掃描電子顯微鏡(SEM)來通過收集二次和背散射電子獲得二維圖像，以及使用切片機(有時被稱為“超薄切片機”)來去除在連續圖像之間的樣品頂部的非常薄(例如，在幾十納米范圍內)的部分。通過在掃描電子顯微鏡的真空室中安裝切片機，可以使該過程更有效。先前的切片機具有各種缺點，如本文進一步所述。因此，需要切片機技術的改進。
技術實現思路
在一些實施方案中，一種用于去除樣品的頂部的一個薄的部分的切片機包含：基板；基座，聯接到基板，使得基座能夠從成像位置移動到切割位置，其中基座具有能夠在上面安裝樣品的暴露表面；刀片，聯接到基板，使得當基座處于成像位置時，能夠通過在垂直于基座的暴露表面的方向上移動刀片來調整相對于基板的刀片位置，以選擇性地改變刀片和基板之間的距離，其中切割位置比成像位置更靠近刀片。在一些實施例中，切片機安裝在被配置成使用相機對樣品的表面成像的熒光顯微鏡上。在一些實施例中，切片機安裝在被配置成使用相機對樣品的表面成像的陰極發光顯微鏡上。在一些實施例中，切片機安裝在被配置成使用相機對樣品的表面成像的光電發射電子顯微鏡上。在一些實施例中，刀片安裝在聯接到基板的第一計算機控制的線性致動器上。在一些實施例中，基座安裝在桿上，所述桿通過樞轉軸承聯接到基板。在一些實施例中，通過聯接到基板的第二計算機控制的線性致動器的致動，基座能夠圍繞樞轉軸承旋轉。在一些實施例中，第一致動器被配置成接收控制信號以引導刀片的運動，切片機進一步包含：傳感器，所述傳感器聯接到第一致動器并且被配置成產生指示相對于基板的刀片位置的輸出信號；以及，計算機程序，被配置成接收來自傳感器的輸出信號，至少部分地基于來自傳感器的輸出信號產生控制信號，并且將控制信號傳輸到第一致動器。在一些實施例中，切片機進一步包含定位在基座上的樣品。在一些實施例中，能夠從可用工作距離的范圍中選擇掃描電子顯微鏡的樣品和極片之間的工作距離。在一些實施例中，電壓被施加到樣品。在一些實施例中，樣品與切片機電隔離。在一些實施例中，刀片是壓電控制的振蕩金剛石刀片。在一些實施例中，切片機進一步包含包括處理器和存儲器的計算裝置，存儲器存儲用于組合樣品的多個圖像以創建樣品的三維表示的計算機可讀指令。在一些實施方案中，一種被配置成安裝在掃描電子顯微鏡內的切片機包含：聯接到致動器的刀片，其中致動器聯接到掃描電子顯微鏡的平臺，使得致動器能夠在平行于掃描電子顯微鏡的射束軸的方向上相對于平臺移動刀片，并且其中致動器被配置成接收控制信號以引導刀片的運動；傳感器，聯接到致動器并且被配置成產生指示相對于基板的刀片位置的輸出信號；以及，計算機程序，被配置成接收來自傳感器的輸出信號，至少部分地基于來自傳感器的輸出信號產生控制信號，并且將控制信號傳輸到致動器。在一些實施例中，切片機進一步包含基座，所述基座聯接到平臺，使得基座能夠從射束軸上的成像位置移動到離開射束軸的切割位置，其中切割位置比成像位置更靠近刀片。在一些實施方案中，一種方法包含：將樣品定位在掃描電子顯微鏡內的切片機上的成像位置處，其中成像位置在掃描電子顯微鏡的射束軸上；對樣品的第一暴露表面成像；設置切片機的刀片的高度；將樣品從成像位置移動到切割位置，其中切割位置比成像位置更靠近刀片并且不在射束軸上；移動樣品穿過刀片，以去除樣品的一部分并露出樣品的第二暴露表面；將樣品移動到成像位置；以及對樣品的第二暴露表面成像。在一些實施例中，方法進一步包含在設置刀片的高度之后，在反饋控制下保持刀片的高度。在一些實施例中，方法進一步包含在對第二暴露表面成像之前，將掃描電子顯微鏡的電子束聚焦在第二暴露表面處。在一些實施例中，方法進一步包含在對第二暴露表面成像之前，沿著射束軸調整樣品。在一些實施例中，方法進一步包含在沿著射束軸調整樣品之后，將掃描電子顯微鏡的電子束聚焦在第二暴露表面處。在一些實施例中，對樣品的第一暴露表面成像的動作包含使用掃描電子顯微鏡來捕獲第一暴露表面的多個組成圖像，以及將多個組成圖像拼接在一起以形成第一暴露表面的合成圖像。在一些實施例中，方法進一步包含使切片機傾斜，使得射束軸不垂直于樣品的暴露表面。在一些實施例中，方法進一步包含使切片機旋轉。在一些實施例中，方法進一步包含用聚苯乙烯泡沫塑料清潔桿清潔刀片。在一些實施例中，切片機安裝在中間平臺上，并且中間平臺安裝在掃描電子顯微鏡的內置平臺上。通過參考附圖進行的幾個實施方案的以下詳細描述，所公開的技術的前述和其他特征和優點將變得更加顯而易見。附圖說明圖1是示例性切片機的俯視立體圖。圖2A至圖2C以更大的比例示出圖1的切片機的部分。圖2D圖示使用圖1的切片機的方法。圖3A至圖3O是在串行塊面掃描電子顯微術期間產生的組織樣品的幾個連續掃描電子顯微鏡圖像，以及圖示組織樣品的連續掃描電子顯微鏡圖像之間的計算差異的圖像。圖4A是示出當幾次移動組織樣品穿過刀片時，測量切片機刀片的豎向位置的電容傳感器的輸出的曲線圖。圖4B是示出彼此重疊的圖4A的數據序列的曲線圖。圖5是示出多個組成掃描電子顯微鏡圖像的位置的圖解。圖6A至圖6C是在不同工作距離下拍攝的相同樣品的掃描電子顯微鏡圖像。圖7是其中電壓已施加到電隔離樣品的切片機的側視圖。圖8A至圖8C圖示使用掃描電子顯微鏡中的切片機(諸如圖1的切片機)控制樣品的傾斜的能力。圖9A至圖9E是另一示例性切片機的不同視圖。圖10A和圖10B分別圖示使用所公開的切片機切割的15納米薄的組織切片的XY和XZ視圖。圖11是又一示例性切片機的立體圖。具體實施方式本文所述的切片機可以用于各種顯微分析技術，諸如用于掃描電子顯微術、基于光的(光學的，例如熒光的)顯微術、陰極發光顯微術，或用于這些技術的組合。例如，樣品可以安裝在如下所述的切片機上，該切片機可以直接安裝在普通的基于光的(光學)(例如，熒光)顯微鏡的物鏡下。這些實施方案可以在大氣條件下和在沒有掃描電子顯微鏡的情況下操作。這些技術可以利用本領域中已知的各種熒光顯微技術(例如，多光子顯微術、超分辨率顯微術等)。在一些實施例中，本文所述的切片機可以用于光學和/或陰極發光顯微術和掃描電子顯微術，并且可以捕獲和存儲連續暴露表面的圖像。也可以對圖像進行數字分析和重組，以在高度的顯微分辨率下提供組織的三維圖像或表示，例如，以確定或映射對象的神經元回路。在一些實施方案中，這可以通過使用例如熒光檢測器、相機或CMOS傳感器經由掃描電子顯微鏡的內部真空室中的觀察孔對樣品成像來實現。在一些情況下，可以本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于去除樣品的頂部的一個薄的部分的切片機，包含：基板；基座，聯接到所述基板，使得所述基座能夠從成像位置移動到切割位置，其中所述基座具有能夠在上面安裝所述樣品的暴露表面；刀片，聯接到所述基板，使得當所述基座處于所述成像位置時，能夠通過在垂直于所述基座的所述暴露表面的方向上移動所述刀片來調整相對于所述基板的刀片位置，以選擇性地改變所述刀片和所述基板之間的距離；其中所述切割位置比所述成像位置更靠近所述刀片。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.05.12 US 61/991,9291.一種用于去除樣品的頂部的一個薄的部分的切片機，包含：基板；基座，聯接到所述基板，使得所述基座能夠從成像位置移動到切割位置，其中所述基座具有能夠在上面安裝所述樣品的暴露表面；刀片，聯接到所述基板，使得當所述基座處于所述成像位置時，能夠通過在垂直于所述基座的所述暴露表面的方向上移動所述刀片來調整相對于所述基板的刀片位置，以選擇性地改變所述刀片和所述基板之間的距離；其中所述切割位置比所述成像位置更靠近所述刀片。2.根據權利要求1所述的切片機，其中所述切片機安裝在熒光顯微鏡上，所述熒光顯微鏡被配置成使用相機對所述樣品的表面成像。3.根據權利要求1所述的切片機，其中所述切片機安裝在陰極發光顯微鏡上，所述陰極發光顯微鏡被配置成使用相機對所述樣品的表面成像。4.根據權利要求1所述的切片機，其中所述切片機安裝在光電發射電子顯微鏡上，所述光電發射電子顯微鏡被配置成使用相機對所述樣品的表面成像。5.根據權利要求1至4中任一項所述的切片機，其中所述刀片安裝在第一計算機控制的線性致動器上，所述第一計算機控制的線性致動器聯接到所述基板。6.根據權利要求5所述的切片機，其中所述基座安裝在桿上，所述桿通過樞轉軸承聯接到所述基板。7.根據權利要求6所述的切片機，其中通過聯接到所述基板的第二計算機控制的線性致動器的致動，所述基座能夠圍繞所述樞轉軸承旋轉。8.根據權利要求7所述的切片機，其中所述第一致動器被配置成接收控制信號以引導所述刀片的運動，所述切片機進一步包含：傳感器，聯接到所述第一致動器并且被配置成產生指示相對于所述基板的所述刀片位置的輸出信號；以及計算機程序，被配置成接收來自所述傳感器的所述輸出信號，至少部分地基于來自所述傳感器的所述輸出信號產生所述控制信號，并且將所述控制信號傳輸到所述第一致動器。9.根據權利要求1至8中任一項所述的切片機，進一步包含定位在所述基座上的樣品。10.根據權利要求9所述的切片機，其中能夠從可用工作距離的范圍中選擇掃描電子顯微鏡的所述樣品和極片之間的工作距離。11.根據權利要求9或權利要求10所述的切片機，其中電壓被施加到所述樣品。12.根據權利要求11所述的切片機，其中所述樣品與所述切片機電隔離。13.根據權利要求1至12中任一項所述的切片機，其中所述刀片是壓電控制的振蕩金剛石刀片。14.根據權利要求1至13中任一項所述的切片機，進一步包含包括處理器和存儲器的計算裝置，所述存儲器存儲用于組合所述樣品的多個圖像以創建所述樣品的三維表示的計算機可讀指令。15.根據權利要求1至14中任一項所述的切片機，進一步包含線性壓電平臺，所述線性壓電平臺被配置成重置電容傳感器而不改變所述刀片相對于所述基板的位置。16.根據權利要求1至15中任一項所述的切片機，進一步包含聚合物支架，所述聚合物支架聯接到所述基座并且被配置成固定法拉第杯。17.根據權利要求1至16中任一項所述的切片機，進一步包含鉗，所述鉗聯接到所述基座和所述基板，并且被配置成在樣品安裝到所述基座時，使所述基座相對于所述基板保持靜止。18.一種被配置成安裝...

【專利技術屬性】
技術研發人員：K·L·布里格曼，
申請(專利權)人：美國政府由衛生和人類服務部的部長所代表，
類型：發明
國別省市：美國;US