一株能分泌識別亞甲基藍的單克隆抗體的單克隆細胞株C4及其應用制造技術

一株能分泌識別亞甲基藍的單克隆抗體的單克隆細胞株C4及其應用，屬于免疫化學技術領域。本發明專利技術提供的單克隆細胞株C4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.?12026。此單克隆細胞株C4分泌的單克隆抗體能夠特異性識別亞甲基藍，特異性好，且靈敏度高，半數抑制濃度（IC50）為21.13?ng/mL；用此單克隆抗體能夠用于建立亞甲基藍的免疫檢測技術。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一株能分泌識別亞甲基藍的單克隆抗體的單克隆細胞株C4及其應用，屬于免疫化學

技術介紹
亞甲基藍屬于噻嗪類染料，自孔雀石綠被明令禁止用于水產養殖中后，其替代品亞甲基藍的殘留問題引起廣泛關注和重視。亞甲基藍最初開始用于尿道感染和瘧疾的防治，隨著研究不斷地深入，有研究發現亞甲基藍能殺死腫瘤細胞并對腫瘤細胞有較高的親和性，因此亞甲基藍經放射性同位素標記后用來診斷、定位和治療多種腫瘤。亞甲基藍同時具有氧化性和還原性，在臨床上可作為解毒劑用于氰化物和亞硝酸鹽等藥物中毒。由于亞甲基藍在水溶液中呈離子型狀態，將與周邊微生物的酶系統競爭氫離子，導致微生物酶失活致死。故亞甲基藍還在獸醫領域特別是水產養殖中用作消毒劑。有研究表明，亞甲基藍還對一些魚病如斜管蟲病，小爪蟲，水霉病等有較好的療效。因此，當一些三苯甲烷類染料如孔雀石綠和結晶紫被明確禁止用于水產養殖后，亞甲基藍作為替代品成為養殖戶們親睞的對象。除了消毒劑和魚病預防外，亞甲基藍還可在水產品運輸過程中作為抗真菌劑使用以降低死亡率。亞甲基藍的毒性低于孔雀石綠，然而在水產養殖過程中任何對亞甲基藍的不合理使用，都可能造成亞甲基藍的蓄積，另外隨著染料的廣泛運用，作為陽離子染料的亞甲基藍隨著廢水大量進入周邊水域，造成環境中亞甲基藍濃度超標，當人或動物長期暴露在高濃度的亞甲基藍環境中時，容易引起中毒現象，毒副作用有致突變，紅細胞形態改變或貧血，壞死性膿腫等，嚴重時可致死。因此，包括美國，日本，歐盟在內的國家或組織不允許亞甲基藍用于水產養殖中。在我國，亞甲基藍由于其價格低廉，療效明確，養殖戶對其毒副作用了解較少，亞甲基藍在水產養殖中作為消毒劑及孔雀石綠的替代品被廣泛運用，因此其殘留問題不容小覷，對其殘留的檢測技術研究對我國的食品安全及出口貿易具有重要意義。我國雖然還未出臺相關法律法規，但是檢測技術的研究是監督工作的先驅，面對國際貿易的技術壁壘，對亞甲基藍及其代謝殘留檢測技術的研究，尤其是快速簡便篩查技術的研究刻不容緩。已發表的文獻中對亞甲基藍的檢測技術仍停留在儀器方法上，如液相色譜技術，毛細管電泳技術和離子色譜法，檢測器一般為質譜或光學檢測器，前處理技術有液液萃取及固相萃取技術。目前，對亞甲基藍的主流檢測手段主要是高效液相色譜串聯質譜法，只是在檢測器以及樣品前處理手段上如萃取，凈化等步驟上略有不同。對水產品中亞甲基藍的免疫分析技術研究基本處于空白階段。建立亞甲基藍的免疫檢測技術，首先要獲得特異性識別亞甲基藍的單克隆抗體。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術提供了一種單克隆細胞株C4，其能夠產生特異性識別亞甲基藍的單克隆抗體，能夠用于建立亞甲基藍的免疫檢測技術。本專利技術的技術方案：一株能分泌識別亞甲基藍的單克隆抗體的單克隆細胞株C4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12026。一種識別亞甲基藍的特異性單克隆抗體，其由保藏編號為CGMCCNo.12026的單克隆細胞株C4分泌產生。所述的識別亞甲基藍的特異性單克隆抗體的應用，在制備檢測亞甲基藍的免疫工具中的應用。所述的識別亞甲基藍的特異性單克隆抗體的應用，在檢測魚肉中亞甲基藍的應用。本專利技術的有益效果：由單克隆細胞株C4產生的特異性單克隆抗體能夠特異性識別亞甲基藍；且靈敏度好，半數抑制濃度（IC50）為21.13ng/mL；為研制食品中亞甲基藍檢測的免疫工具提供了原料，例如酶聯免疫技術和免疫層析試紙條。生物材料樣品保藏：本專利技術提供的雜交瘤細胞株C4，分類命名為單克隆細胞株，該細胞株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2016年1月20日，保藏編號為CGMCCNo.12026。附圖說明圖1亞甲基藍單抗的標準曲線。圖2完全抗原的紫外鑒定結果。具體實施方式本專利技術提供了單克隆細胞株C4及其分泌的抗亞甲基藍的特異性單克隆抗體。下面結合具體實施方式對本專利技術做進一步的說明，實施例中如無特殊說明均為常規方法。實施例1單克隆細胞株C4的制備1、小鼠免疫和抗血清篩選選擇半抗原（MB-HS）通過活化酯法分別與血藍蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）偶聯，形成免疫原（MB-HS-KLH）和包被原（MB-HS-OVA）。首免采用完全佐劑和免疫原1︰1體積混合，以皮下免疫方式免疫BALB/c小鼠，免疫間隔時間4周，六免后7-10d，以包被原包被酶標板，采用間接競爭酶聯免疫法測定血清的效價和抑制，選擇效價高并抑制好的小鼠進行融合。其中，半抗原為亞甲基藍衍生物，半抗原的結構為：2、細胞融合小鼠抗血清評價后第21天，選擇符合要求的小鼠進行腹腔沖刺免疫。具體過程如下：將免疫原用生理鹽水稀釋至200μL體積，沖免劑量為最后一次加強免疫的劑量的一半，將稀釋好的免疫原注入1mL注射器，從小鼠左側腹腔緩慢注入小鼠體內。小鼠沖免3天后，采用斷頸的方式處死小鼠，并迅速放入100mL75%酒精中,小鼠在酒精中浸泡5-10min后轉移到超凈工作臺取出脾臟，放置在200目不銹鋼篩網上，用5mL注射器內芯輕輕研磨，并不斷用RPMI1640培養基進行沖洗，將脾細胞懸浮液收集到50mL離心管中，1200r/min離心8min，棄上清，輕輕吹打離心管底部以分散細胞，加入RPMI1640培養基重懸脾細胞，并轉移到新的50mL離心管中。重復離心三次后加入10mLRPMI1640培養基，混勻，取出其中的100μL稀釋1000倍進行計數，余下的備用。脾細胞收集好后，開始收集處于對數生長期的瘤細胞。瘤細胞與脾細胞按計數比1︰2-10比例混合均勻，1200r/min離心8min，棄上清，用食指輕輕彈打離心管底部使細胞分散均勻，準備融合：第1min內，將預熱的1mLPEG緩慢貼壁勻速滴加到混合細胞中，邊加邊輕輕搖動離心管；第2min內，將離心管握在手中，靜置；第3-4min，以1mL/min的速度緩慢滴加2mL的RPMI1640，邊加邊搖動離心管；第5-6min內，以1mL/30s的速度緩慢滴加4mL的RPMI1640，邊加邊搖；第7min內，以1mL/10s的速度加入RPMI1640。最后加入RPMI1640至20mL,將離心管用封口膜封好放到培養箱中靜置5min，800r/min離心8min，棄上清，用食指輕輕彈打離心管底部使細胞分散開來，緩慢加入HAT選擇培養基，輕輕混勻后按200μL/孔轉移到96孔細胞板中（鋪板數量根據細胞數量而定），放在CO2培養箱中培養。細胞融合后第3天進行HAT選擇培養基半換液，第6天進行HAT培養基全換液，第7天取細胞上清進行細胞篩選。融合后第7天，根據小鼠抗血清的效價和抑制測定結果，確定細胞篩選所需的包被濃度，進行包板封閉。首先進行細胞陽性的測定，再取出陽性孔的細胞上清，進行抑制測定，抑制測定時需進行適當的稀釋使所有孔的OD值盡量都在1.5左右，在96孔板中分別加入一定濃度的亞甲基藍標準品和標準品稀釋液，50μL/孔，按50μL/孔加入稀釋好的細胞上清，37℃烘箱溫育30min，再按常規ELISA操作方法洗板加入二抗等直至測定吸光值。根據檢測結果，挑選抑制較好陽性較高的4-6個孔進行第本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株能分泌識別亞甲基藍的單克隆抗體的單克隆細胞株C4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.?12026。

【技術特征摘要】
1.一株能分泌識別亞甲基藍的單克隆抗體的單克隆細胞株C4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12026。2.一種識別亞甲基藍的特異性單克隆抗體，其特征在于：其由保藏編號為CGMCCNo.1202...

【專利技術屬性】
技術研發人員：匡華，彭娟，胥傳來，徐麗廣，劉麗強，宋珊珊，吳曉玲，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32