本發(fā)明專利技術(shù)提供一種通過基因工程破壞基因或者抑制基因表達(dá)來得到不飽和脂肪酸產(chǎn)生能力提高的原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法。所述原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法其特征在于，所述原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法為通過基因工程對原生藻菌的基因進(jìn)行破壞或者表達(dá)抑制，特別是來自原生藻菌的選自金黃色破囊壺菌(Thraustochytrium?aureum)、Parietichytrium?sarkarianum、破囊壺菌(Thraustochytrium?roseum)或者Parietichytrium?sp.中的被破壞或抑制表達(dá)的基因是脂肪酸生物合成相關(guān)基因。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及原生藻菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，通過基因工程對原生藻菌的基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制。特別是，涉及對脂肪酸生物合成相關(guān)基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制的轉(zhuǎn)化方法、由此進(jìn)行的原生藻菌的脂肪酸組成的改變方法、使原生藻菌中積蓄大量脂肪酸的方法以及不飽和脂肪酸含量增加的原生藻菌、從這些不飽和脂肪酸含量增加的原生藻菌中生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法等。
技術(shù)介紹
多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFA)是動物以及人類的營養(yǎng)中的重要成分。由于如二十碳五烯酸(EPA)或者二十二碳六烯酸(DHA)這樣的ω3多不飽和脂肪酸(也稱為n-3多不飽和脂肪酸)在包括幼兒大腦的發(fā)育、眼睛的機(jī)能、激素以及其它的信號物質(zhì)的合成以及心血管障礙、癌癥和糖尿病的預(yù)防在內(nèi)的健康狀況方面產(chǎn)生各種作用(非專利文獻(xiàn)1、2)，因此，這些多不飽和脂肪酸是人類的營養(yǎng)中的重要成分。基于上述理由，制造多不飽和脂肪酸成為必要。另一方面，已知被分類為網(wǎng)粘菌(Labyrinthula)類的微生物可以制造多不飽和脂肪酸。在屬于破囊壺菌科的微生物中，已經(jīng)報道有使用裂殖壺菌屬的微生物的含有多不飽和脂肪酸的磷脂的制造方法(專利文獻(xiàn)1)，具有二十二碳六烯酸生產(chǎn)能力的破囊壺菌(Thraustochytrium)屬的微生物(專利文獻(xiàn)2)等。由于這些不飽和脂肪酸使得強(qiáng)化食物和/或飼料成為可能，因此，特別需要這些不飽和脂肪酸的，特別是在真核生物體系中的簡便并且經(jīng)濟(jì)的制造方法。在網(wǎng)粘菌類中，作為外源基因的導(dǎo)入方法，已經(jīng)報道有對于裂殖壺菌(Schizochytrium)屬的特定的菌株(在現(xiàn)有的分類體系(非專利文獻(xiàn)3)中屬于Aurantiochytrium屬(非專利文獻(xiàn)4))的方法(專利文獻(xiàn)3、4)。另外，作為通過轉(zhuǎn)化使脂肪酸組成發(fā)生變化的方法，已知有破壞聚酮合成酶(polyketidesynthase，PKS)基因，其結(jié)果脂肪酸組成有變化的例子(非專利文獻(xiàn)5)，但是，至今未知有操作構(gòu)成延長酶(elongase)/去飽和酶路徑的酶來使脂肪酸組成變化的報道。在這樣的狀況下，本專利技術(shù)者們發(fā)現(xiàn)：將延長酶/去飽和酶基因?qū)敫鞣N網(wǎng)粘菌類中，使脂肪酸組成發(fā)生變化，并且已經(jīng)進(jìn)行了專利申請(專利文獻(xiàn)5)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本特開2007-143479號公報專利文獻(xiàn)2：日本特開2005-102680號公報專利文獻(xiàn)3：日本特開2006-304685號公報專利文獻(xiàn)4：日本特開2006-304686號公報專利文獻(xiàn)5：國際專利公開WO2011/037207號公報專利文獻(xiàn)6：國際專利公開WO1997/011094號公報專利文獻(xiàn)7：美國專利公開US2005/0014231號公報專利文獻(xiàn)8：日本特表2007-532104號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：PoulosA.,Lipids,30,1-14(1995)非專利文獻(xiàn)2：HorrocksL.A.andYeoY.K.,PharmacolRes.,40,211-225(1999)非專利文獻(xiàn)3：YokoyamaR.,HondaD.,Mycoscience,48,199-211(2007)非專利文獻(xiàn)4：第60屆日本生物工學(xué)會大會演講要點(diǎn)集，p136(2008)非專利文獻(xiàn)5：LippmeierJ.C.etal.,Lipids,44(7),621-630(2009)非專利文獻(xiàn)6：TononT.etal.,FEBSLett.,553,440-444(2003)非專利文獻(xiàn)7：ThompsonJ.D.etal.,NucleicAcidsRes.,22,4673-4680(1994)非專利文獻(xiàn)8：YazawaK.,Lipids,31,Supple.297-300(1996)非專利文獻(xiàn)9：JiangX.etal.,WeiShengWuXueBao.,48(2),176-183(2008)非專利文獻(xiàn)10：PEREIRAS.L.etal.,Biochem.J.,378,665-671(2004)非專利文獻(xiàn)11：PrasherD.C.etal.,Gene,111(2),229-233(1992)非專利文獻(xiàn)12：ChalfieM.etal.,Science,263,802-805(1994)非專利文獻(xiàn)13：SouthernP.J.,andBerg,P.,J.Molec.Appl.Gen.,1,327-339(1982)非專利文獻(xiàn)14：SaitouN.etal.,Mol.Biol.Evol.,4,406-425(1987)非專利文獻(xiàn)15：AusubelF.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Unit13(1994)非專利文獻(xiàn)16：GuthrieC.,FinkG.etal.,MethodsinEnzymology：GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,Volume194(1991)非專利文獻(xiàn)17：AbeE.,etal.,J.Biochem,142,31561-31566(2006)非專利文獻(xiàn)18：《生物實(shí)驗(yàn)說明第2卷基因分析的基礎(chǔ)》，p117-128，秀潤社，1995年發(fā)行非專利文獻(xiàn)19：日本農(nóng)藝化學(xué)會會志,77,2,150-153(2003)非專利文獻(xiàn)20：《生物實(shí)驗(yàn)說明第2卷基因分析的基礎(chǔ)》，p63-68，秀潤社，1995年發(fā)行非專利文獻(xiàn)21：Sanger,F.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci,74,5463(1977)非專利文獻(xiàn)22：Meyer,A.,etal.J.LipidRes.,45,1899-1909(2004)非專利文獻(xiàn)23：CiganandDonahue,1987；Romanosetal.,1992非專利文獻(xiàn)24：Qiu,X.,etal.J.Biol.Chem.,276,31561-6(2001)非專利文獻(xiàn)25：DIG說明書集[日語版]8th,RocheAppliedScience
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題本專利技術(shù)的目的在于，為了提高原生藻菌的有用物質(zhì)的產(chǎn)生能力而通過基因工程對原生藻菌的基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本專利技術(shù)的目的在于，通過基因工程對原生藻菌的有用物質(zhì)的產(chǎn)生所涉及的基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制，改變有用物質(zhì)的產(chǎn)生能力，由此提供改變原生藻菌產(chǎn)生的脂肪酸組成的方法、使原生藻菌中積蓄大量脂肪酸的方法、不飽和脂肪酸的制造方法、不飽和脂肪酸含量增加的原生藻菌、由這些不飽和脂肪酸含量增加的原生藻菌生產(chǎn)不飽和脂肪酸。根據(jù)本專利技術(shù)，可以提供改變原生藻菌產(chǎn)生的脂肪酸組成以及使原生藻菌積蓄大量脂肪酸的方法，從而能夠高效地制造多不飽和脂肪酸。解決技術(shù)問題的技術(shù)手段本專利技術(shù)者們鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的情況專心研究，其結(jié)果，為了提高原生藻菌產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的能力，通過基因工程對原生藻菌的基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制來進(jìn)行轉(zhuǎn)化上取得了成功，進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)了通過基因工程對原生藻菌的基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制來進(jìn)行原生藻菌產(chǎn)生的脂肪酸組成的改變的方法，以及使該轉(zhuǎn)化原生藻菌中積蓄大量不飽和脂肪酸的方法，并通過進(jìn)一步深入進(jìn)行其實(shí)用化的研究、開發(fā)，至此完成本專利技術(shù)。本專利技術(shù)的主要內(nèi)容是以下的(1)至(12)所記載的原生藻菌本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種原生藻菌，其中，所述原生藻菌是通過對原生藻菌的基因組的基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制，從而其脂肪酸組成被改變。
【技術(shù)特征摘要】
2010.10.01 JP 2010-224225;2011.08.18 JP 2011-179191.一種原生藻菌，其中，所述原生藻菌是通過對原生藻菌的基因組的基因進(jìn)行破壞和/或表達(dá)抑制，從而其脂肪酸組成被改變。2.如權(quán)利要求1所述的原生藻菌，其中，所述原生藻菌為網(wǎng)粘菌類。3.如權(quán)利要求2所述的原生藻菌，其中，網(wǎng)粘菌類為屬于網(wǎng)粘菌屬(Labyrinthula)、交鏈孢霉屬(Althornia)、Aplanochytrium屬、Japonochytrium屬、Labyrinthuloides屬、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)、Aurantiochytrium屬、破囊壺菌屬(Thraustochytrium)、吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)、Oblongichytrium屬、Botryochytrium屬、Parietichytrium屬或者Sicyoidochytrium屬的微生物。4.如權(quán)利要求3所述的原生藻菌，其中，微生物為金黃色破囊壺菌(Thraustochytriumaureum)、Parietichytriumsarkarianum、破囊壺菌(Thraustochytriumroseum)、Parietichytriumsp.或者裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)。5.如權(quán)利要求4所述的原生藻菌，其中，微生物為金黃色破囊壺菌ATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364FERMBP-...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：坂口圭史，濱口理惠，松田高宜，伊東信，長野直樹，林雅弘，本多大輔，沖田裕司，杉本慎一，
申請(專利權(quán))人：國立大學(xué)法人九州大學(xué)，國立大學(xué)法人宮崎大學(xué)，學(xué)校法人甲南學(xué)園，日本水產(chǎn)株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：日本;JP
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