一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，包括：將三價鐵鹽溶于溶劑中，加入檸檬酸鈉，攪拌，加入無水醋酸鈉，攪拌，190～200℃反應(yīng)3～4小時，冷卻，離心，干燥，得到超小四氧化三鐵納米顆粒，然后將納米顆粒分散在超純水中，超聲，EDC和NHS活化，滴加到Mal?PEG?NH2的超純水溶液中，反應(yīng)60～72小時，得到Fe3O4?PEG?Mal的水溶液，然后滴加L?半胱氨酸的超純水溶液，反應(yīng)60～72小時，透析，冷凍干燥，即得。本發(fā)明專利技術(shù)的方法簡單，制備的納米顆粒在小鼠體內(nèi)血液半衰期長，能在動物水平實現(xiàn)血池造影和HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)皮下移植瘤T1增強成像，具有產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化潛能。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于磁共振成像(MRI)造影劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法。
技術(shù)介紹
一直以來，惡性腫瘤都是危害人類生命的頭號殺手，具有死亡率高、難治療以及惡化迅速等特點。因此，腫瘤的早期診斷和特異性治療顯得尤為重要。目前，腫瘤的檢測手段主要有：超聲成像、CT成像、核醫(yī)學(xué)(PET或SPECT)成像以及磁共振成像(MRI)。隨著磁共振技術(shù)的發(fā)展，其掃描時間逐漸縮短，分辨率逐漸提高，對于小病灶的檢測也更加準(zhǔn)確，這也使得磁共振成像技術(shù)成為近年來發(fā)展起來的新型疾病檢測手段。為了提高M(jìn)RI成像診斷的靈敏度和特異性，有必要選擇合適的MRI造影劑。常規(guī)的MRI造影劑主要分為兩類：一類是T1加權(quán)的MRI造影劑，一類是T2加權(quán)的MRI造影劑。至今已有大量文獻(xiàn)報道利用磁性氧化鐵納米顆粒作為MRI陰性造影劑應(yīng)用于癌癥的診斷。然而，在人體血液中、鈣離子富集區(qū)、金屬離子沉積以及人體組織損傷部位在T2成像過程中也會出現(xiàn)信號減弱現(xiàn)象而得到負(fù)造影圖像，這往往會干擾臨床診斷。因此，臨床醫(yī)學(xué)界更期望開發(fā)具有信號增強作用的T1造影劑。而目前應(yīng)用于臨床MRI的小分子T1造影劑都存在不可克服的缺陷，如血液循環(huán)時間過短、吸附蛋白質(zhì)而易于聚集等。尤其是釓基造影劑一定濃度下還存在腎毒性。相比之下，金屬或者金屬氧化物納米顆粒更加具有安全性。作為生物體內(nèi)MRI陽性造影劑，超小Fe3O4納米顆粒必須具有良好的水溶性、穩(wěn)定性、生物相容性、和較高的T1弛豫率。檸檬酸鈉是一種小分子羧酸鹽，擁有三個羧基，被廣泛地應(yīng)用于納米材料合成過程中的晶體生長抑制劑和穩(wěn)定劑，不僅能提供影響納米顆粒膠體穩(wěn)定性的電荷排斥力，還使得納米顆粒表面帶上負(fù)電荷的羧基官能團(tuán)，為納米顆粒的表面多功能修飾提供了可行性。檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于兩性離子L-半胱氨酸修飾的超小氧化鐵MRI陽性造影劑及其體內(nèi)MRI診斷應(yīng)用的相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，該方法工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，成本較低；制備的Fe3O4納米顆粒能夠長時間穩(wěn)定分散于水溶液中，不會出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。本專利技術(shù)的一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，包括：(1)將三價鐵鹽溶于溶劑中，加入檸檬酸鈉Na3Cit，攪拌溶解，然后加入無水醋酸鈉，攪拌溶解，190～200℃溶劑熱反應(yīng)3～4小時，冷卻至室溫，離心，干燥，得到超小四氧化三鐵納米顆粒；其中，檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑，無水醋酸鈉作為反應(yīng)助劑、陰離子表面活性劑；(2)將步驟(1)中的超小四氧化三鐵納米顆粒分散在超純水中，超聲，經(jīng)過EDC和NHS活化，將活化后的Fe3O4溶液逐滴加入到Mal-PEG-NH2的超純水溶液中，室溫反應(yīng)60～72小時，得到Fe3O4-PEG-Mal的水溶液；(3)將L-半胱氨酸溶解于超純水中，逐滴加入到步驟(2)中的Fe3O4-PEG-Mal的水溶液中，室溫下反應(yīng)60～72小時，透析，冷凍干燥，得到兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒Fe3O4-PEG-(L-Cysteine)。所述步驟(1)中三價鐵鹽、溶劑、檸檬酸鈉和無水醋酸鈉的比例為1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g。所述三價鐵鹽為六水合氯化鐵，溶劑為一縮二乙二醇DEG。所述步驟(1)中加入檸檬酸鈉后攪拌的條件為：空氣氣氛下80℃攪拌1～2小時。所述步驟(1)中溶劑熱反應(yīng)的容器為50ml的高壓反應(yīng)釜。所述步驟(1)中離心的條件為：8500～9000rpm離心10～15分鐘，棄上清液，用無水乙醇回溶，8500～9000rpm離心10～15分鐘，重復(fù)操作2～3次。所述步驟(1)中干燥的條件為：60～65℃烘干。所述步驟(2)中Fe3O4、EDC和NHS的質(zhì)量比為160～168：134～144：65～70。所述步驟(2)中Fe3O4和Mal-PEG-NH2的質(zhì)量比55～60：9～12。所述步驟(2)中的PEG一端為NH2(氨基)另一端為Mal(馬來酰亞胺基)；平均分子量為2000。所述步驟(3)中Fe3O4-PEG-Mal和L-半胱氨酸的摩爾比為1.5～2：1～1.5。所述步驟(3)中透析的條件為：用截留分子量為8000～14000的透析袋透析2～3天(每次透析所用蒸餾水1.5～2L，共換水6～9次)。所述步驟(3)中兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的粒徑為2～3nm。本專利技術(shù)采用兩性離子L-半胱氨酸(L-Cysteine)對超小Fe3O4納米顆粒進(jìn)行修飾，仿生細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的兩性離子在納米顆粒表面形成保護(hù)性的水化層，能賦予納米粒子良好的分散穩(wěn)定性和生物相容性。L-半胱氨酸作為一種天然的小分子氨基酸，使經(jīng)過兩性離子化的表面改性后的無機納米粒子幾乎不增尺寸，并賦予其優(yōu)異的抗高鹽濃度、抗酸堿性，抗蛋白質(zhì)吸附和抗巨噬細(xì)胞內(nèi)吞性。這些特性恰好彌補了磁性Fe3O4納米顆粒易于吸附蛋白，聚集和體內(nèi)循環(huán)時間短的缺點，使納米顆粒可以在生物體內(nèi)長效循環(huán)，逐步富集于病灶部位。這種特殊的納米界面對于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義。本專利技術(shù)采用了類似的方法(一步溶劑熱法)合成出具有良好膠體穩(wěn)定性的超小Fe3O4納米顆粒。隨后，在Fe3O4納米顆粒的表面通過NH2-PEG-Mal修飾兩性離子L-半胱氨酸，獲得了具有優(yōu)異抗酸堿性，抗蛋白質(zhì)吸附和抗巨噬細(xì)胞吞噬性的納米顆粒，使超小Fe3O4納米顆粒的血液循環(huán)時間大為延長，可以應(yīng)用于T1增強的血池MRI和腫瘤MRI診斷。本專利技術(shù)操作簡便易行，原材料成本低；制備的納米顆粒具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和生物相容性。以傳統(tǒng)的聚合物(NH2-mPEG)修飾的Fe3O4磁性納米顆粒作為對照，相比之下，兩性離子化修飾后的Fe3O4納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)良的抗巨噬細(xì)胞吞噬，抗蛋白吸附性能，血液循環(huán)半衰期增長，可以實現(xiàn)磁共振血池成像和腫瘤成像。該方法制備的L-半胱氨酸修飾的超小氧化鐵納米顆粒在MRI分子影像診斷領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。本專利技術(shù)使用核磁共振波譜(1HNMR)、紅外(FTIR)、熱重分析(TGA)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-OES)、Zeta電勢和水合粒徑(DLS)等方法表征制備的磁性納米顆粒的物理及化學(xué)性質(zhì)。隨后通過紫外比色法評價L-半胱氨酸修飾的納米顆粒的阻抗蛋白吸附能力，并使用MRI成像儀測定納米顆粒的T1成像性能和r1弛豫率，然后通過溶血實驗、CCK-8法和熒光顯微鏡觀察法評價納米顆粒的血液相容性和細(xì)胞毒性，再利用普魯士藍(lán)染色法和ICP-OES評價納米顆粒阻抗巨噬細(xì)胞(RAW264.7)內(nèi)吞的能力。最后，采用體內(nèi)MRI實驗檢測L-半胱氨酸修飾的超小氧化鐵納米顆粒的血池造影以及腫瘤診斷效果。有益效果(1)本專利技術(shù)采用簡單的一步溶劑熱法制備水溶性良好的檸檬酸鈉穩(wěn)定的超小Fe3O4納米顆粒，然后在納米顆粒表面修飾兩性離子L-半胱氨酸，得到的Fe3O4-PEG-(L-Cysteine)納米顆粒應(yīng)用于MR成像陽性造影劑；此法操作工藝簡單，反應(yīng)條件溫和環(huán)境友好，易于操作分離，具有實施商業(yè)化的前景；(2)本專利技術(shù)制備的Fe3O4納米顆粒能夠長時間地穩(wěn)定分散于水中不會出現(xiàn)團(tuán)聚或者沉淀現(xiàn)象；檸檬酸鈉增加了Fe3O4納米顆粒的穩(wěn)定性，修飾兩性離子L-半胱氨酸，在Fe3O4納米本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，包括：(1)將三價鐵鹽溶于溶劑中，加入檸檬酸鈉，攪拌溶解，然后加入無水醋酸鈉，攪拌溶解，190～200℃溶劑熱反應(yīng)3～4小時，冷卻，離心，干燥，得到超小四氧化三鐵納米顆粒；(2)將步驟(1)中的超小四氧化三鐵納米顆粒分散在超純水中，超聲，經(jīng)過EDC和NHS活化，將活化后的Fe3O4溶液逐滴加入到Mal?PEG?NH2的超純水溶液中，室溫反應(yīng)60～72小時，得到Fe3O4?PEG?Mal的水溶液；(3)將L?半胱氨酸溶解于超純水中，逐滴加入到步驟(2)中的Fe3O4?PEG?Mal的水溶液中，室溫下反應(yīng)60～72小時，透析，冷凍干燥，得到兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒Fe3O4?PEG?(L?Cysteine)。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，包括：(1)將三價鐵鹽溶于溶劑中，加入檸檬酸鈉，攪拌溶解，然后加入無水醋酸鈉，攪拌溶解，190～200℃溶劑熱反應(yīng)3～4小時，冷卻，離心，干燥，得到超小四氧化三鐵納米顆粒；(2)將步驟(1)中的超小四氧化三鐵納米顆粒分散在超純水中，超聲，經(jīng)過EDC和NHS活化，將活化后的Fe3O4溶液逐滴加入到Mal-PEG-NH2的超純水溶液中，室溫反應(yīng)60～72小時，得到Fe3O4-PEG-Mal的水溶液；(3)將L-半胱氨酸溶解于超純水中，逐滴加入到步驟(2)中的Fe3O4-PEG-Mal的水溶液中，室溫下反應(yīng)60～72小時，透析，冷凍干燥，得到兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒Fe3O4-PEG-(L-Cysteine)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中三價鐵鹽、溶劑、檸檬酸鈉和無水醋酸鈉的比例為1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，其特征在于，所述三價鐵鹽為六水合氯化鐵，溶劑為一縮二乙二醇DEG。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩性離子修飾的超小氧化鐵顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：史向陽，馬丹，羅宇，王悍，陳靜文，
申請(專利權(quán))人：東華大學(xué)，上海市第一人民醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31