一種用于檢測Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合物及其應(yīng)用。所述引物組合物，由引物組1和引物組2組成；所述引物組1用于Claudin5基因檢測，所述引物組2用于Actin內(nèi)參基因檢測；所述引物組1和引物組2的序列分別如SEQ?ID?NO:1,SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3,SEQ?ID?NO:4所示。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及所述引物組合物在制備用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)采用的技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠特異性的檢測Claudin5基因的表達(dá)水平，避免了同源性基因的干擾；檢測的靈敏度非常高；無需使用熒光探針，應(yīng)用簡單；檢測過程準(zhǔn)確高效，并且檢測時間短，應(yīng)用前景廣闊。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬基因
，本專利技術(shù)涉及一種用于檢測Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合。
技術(shù)介紹
Claudin5是Claudin蛋白家族的重要成員，由Cldn5基因編碼。Claudin5蛋白是組成細(xì)胞間緊密連接的一種主要跨膜蛋白,對維持上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)、功能起著非常重要的作用，并具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、維持細(xì)胞極性及滲透性調(diào)節(jié)等功能。Claudin5主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血腦屏障中占主導(dǎo)地位，是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的重要調(diào)節(jié)因子。已知蛛網(wǎng)膜下腔出血的腦損傷模型中Claudin5的表達(dá)水平顯著降低,從而使旁細(xì)胞通透性增加,產(chǎn)生腦水腫。Claudin5表達(dá)水平研究常用于提示腦缺血缺氧性疾病發(fā)病機(jī)制或藥物療效。實(shí)驗(yàn)研究中小鼠是比較常用的實(shí)驗(yàn)動物，可利用其制作各種疾病模型用于疾病發(fā)病機(jī)制或藥效機(jī)制的研究。例如在缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠的模型中，檢測到Claudin5表達(dá)降低，提示暴露于缺氧環(huán)境中的小鼠，血腦屏障受到破壞，小分子物質(zhì)通透性增加，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)屏障功能障礙。也有研究者采用體外培養(yǎng)Balb/c小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬缺血損傷研究藥物的腦損傷保護(hù)作用及其機(jī)制，研究結(jié)果表明損傷模型中Claudin5基因和蛋白的表達(dá)都明顯降低，而加入清開靈注射液組Claudin5的基因表達(dá)則明顯改善，因而推測清開靈通過調(diào)節(jié)Claudin5的表達(dá),改善血腦屏障通透性從而阻抑腦缺血反應(yīng)過程。對Claudin5表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)研究除采用免疫組化和Western免疫印跡等方法從蛋白水平進(jìn)行研究外，也可從mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究,可采用的技術(shù)方法包括半定量反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR方法等。以蛋白為檢測目標(biāo)的方法通常操作比較繁瑣，耗時。半定量反轉(zhuǎn)錄PCR需要電泳檢測，準(zhǔn)確度不夠高。熒光定量PCR方法是一種高靈敏度、簡便快捷的檢測方法，操作簡單,可應(yīng)用SYBRgreen染料法檢測，無需使用熒光探針，采用熒光定量PCR相對定量方法通過與表達(dá)水平相對穩(wěn)定的管家基因比較來反映目的基因的表達(dá)水平，能很好的輔助Claudin5表達(dá)水平的研究，整個PCR反應(yīng)過程只需1.2小時即可完成。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個目的是提供一種用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合物。本專利技術(shù)所提供的用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合物，由引物組1和引物組2組成；所述引物組1用于Claudin5基因檢測，所述引物組2用于Actin內(nèi)參基因檢測；所述引物組1和引物組2的序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。優(yōu)選地，上述引物組1的上游和下游引物的濃度均為0.1～0.5μM。優(yōu)選地，上述引物組2的上游和下游引物的濃度均為0.1～0.5μM。本專利技術(shù)的另一個目的是上述的引物組合物在制備用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的試劑中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的第三個目的是提供一種檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求1-3中所述的引物組合物和熒光染料。優(yōu)選地，上述熒光染料是SYBRGreen熒光染料。本專利技術(shù)的第四個目的是提供一種非診斷治療目的的用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的方法，包括如下步驟：步驟1：提取樣品中RNA；步驟2：將步驟1中提取出來的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；步驟3：以權(quán)利要求1中所述的引物組為引物，用熒光定量PCR法檢測Claudin5基因以及Actin內(nèi)參基因表達(dá)水平。優(yōu)選地，上述熒光定量PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火34s運(yùn)行40個循環(huán)；最后40℃10s結(jié)束反應(yīng)。步驟4：采用2-△△CT相對定量方法計算與對照組樣品比較的Claudin5基因相對表達(dá)水平。技術(shù)效果本專利技術(shù)采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：（1）特異性強(qiáng)本專利技術(shù)設(shè)計Claudin5基因和Actin基因的引物，通過比對分析設(shè)計的引物之間的二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，最終設(shè)計出了2對引物組，能夠特異性的檢測Claudin5基因的表達(dá)水平，避免了同源性基因的干擾，通過對Claudin5的表達(dá)水平進(jìn)行研究有助于明確疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物的療效判斷。（2）檢測敏感性高常規(guī)對Claudin5表達(dá)水平的研究，通常采用免疫組化和Western免疫印跡等方法從蛋白水平進(jìn)行研究，以蛋白為檢測目標(biāo)的方法通常操作比較繁瑣，耗時。此外，也可以檢測Claudin5的mRNA量，但通常半定量反轉(zhuǎn)錄PCR需要電泳檢測，準(zhǔn)確度不夠高。本專利技術(shù)建立的SYBRgreen實(shí)時熒光定量RT-PCR方法對樣品中的Claudin5表達(dá)水平進(jìn)行定量，其檢測的靈敏度非常高，用該技術(shù)建立的試劑盒可用于對Claudin5的表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量。（3）操作方便簡單本專利技術(shù)采用染料法檢測，無需使用熒光探針，應(yīng)用簡單，采用熒光定量PCR相對定量方法通過與表達(dá)水平相對穩(wěn)定的管家基因比較來反映目的基因的表達(dá)水平，能很好的輔助Claudin5表達(dá)水平的研究。（4）檢測時間短本專利技術(shù)建立的SYBRgreen實(shí)時熒光定量RT-PCR方法無需進(jìn)行電泳，可直接通過電腦來觀察反應(yīng)結(jié)果，整個PCR反應(yīng)過程只需1.2小時即可完成。而常規(guī)的RT-PCR方法至少需要3.5個小時來完成擴(kuò)增反應(yīng)，然后還需要花2個小時進(jìn)行凝膠電泳來觀察結(jié)果。根據(jù)NCBI公布的MusmusculusCldn5的mRNA序列（序列號：NM_013805.4）設(shè)計Claudin5引物序列見表1：表1.Claudin5引物設(shè)計引物名稱序列SEQIDNO.F-CldnCAGTTAAGGCACGGGTAGCASEQIDNO:1R-CldnCAACGATGTTGGCGAACCAGSEQIDNO:2根據(jù)NCBI公布的MusmusculusActin的mRNA序列（序列號：NM_007393.5）設(shè)計引物序列見表2：表2.Actin引物設(shè)計引物名稱序列SEQIDNO.F-actiGATCAGCAAGCAGGAGTACGASEQIDNO:3R-actinAAACGCAGCTCAGTAACAGTSEQIDNO:4附圖說明圖1.為本專利技術(shù)實(shí)施例一中的Claudin5和Actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線，其中A為Claudin5基因擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線，B為Actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線。圖2.為本專利技術(shù)實(shí)施例二中c-MET單抗對小鼠腦梗模型Claudin5基因表達(dá)水平的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本專利技術(shù)。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本專利技術(shù)而不用于限制本專利技術(shù)的范圍。實(shí)施例一本實(shí)施例為引物組合物的使用方法，具體包括以下步驟：步驟1：組織或細(xì)胞RNA提取用商品化試劑盒來提取組織或細(xì)胞RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，并控制提取質(zhì)量，OD260/280測定值為2.0。本實(shí)施例用天根總RNA提取試劑盒來提取組織或細(xì)胞RNA，具體操作按說明書進(jìn)行。步驟2：cDNA反轉(zhuǎn)錄取大約500ngRNA，用商品化試劑盒來PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，具體操作按說明書進(jìn)行。步驟3：熒光定量PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中每種模板分別加入兩種熒光定量PCR反應(yīng)體系，分別進(jìn)行GRP78和RPL19基因檢測，一種反應(yīng)體系包含組分如下：另一種反應(yīng)體系包含組分如本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合物，其特征在于：由引物組1和引物組2組成；所述引物組1用于Claudin5基因檢測，所述引物組2用于Actin內(nèi)參基因檢測；所述引物組1和引物組2的序列分別如SEQ?ID?NO:1,?SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3,?SEQ?ID?NO:4所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合物，其特征在于：由引物組1和引物組2組成；所述引物組1用于Claudin5基因檢測，所述引物組2用于Actin內(nèi)參基因檢測；所述引物組1和引物組2的序列分別如SEQIDNO:1,SEQIDNO:2和SEQIDNO:3,SEQIDNO:4所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合物，其特征在于，所述的引物組1的上游和下游引物的濃度均為0.1μM-0.5μM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的引物組合物，其特征在于，所述的引物組2的上游和下游引物的濃度均為0.1μM-0.5μM。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的引物組合物在檢測小鼠Claudin5基因表達(dá)水平的試劑中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的引物組合物的應(yīng)用，其特征在于，采用2-△△CT相對定量方法計算不...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔣明，于麗華，劉敏亞，章程，
申請(專利權(quán))人：同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32