一種異細交鏈孢菌酮酸化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其使用方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種異細交鏈孢菌酮酸的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法。該試劑盒包括包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發(fā)光酶標板、異細交鏈孢菌酮酸抗體、酶標抗抗體、異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液、化學發(fā)光液、濃縮洗滌液。本發(fā)明專利技術還公開了利用所述試劑盒檢測異細交鏈孢菌酮酸殘留的方法。本發(fā)明專利技術提供的檢測異細交鏈孢菌酮酸的試劑盒采用間接競爭化學發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附分析技術，最大檢測范圍為0.2～3.78ng/mL，靈敏度為0.78ng/mL，檢出限為0.032ng/mL，回收率為82.4～105.8%，檢出限低、靈敏度高、穩(wěn)定性好，成本低，非常適合大量樣品的篩查，具有重要的實際應用推廣意義。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測
，具體地，涉及一種異細交鏈孢菌酮酸化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其使用方法。
技術介紹
鏈格孢霉廣泛分布于泥土和谷物、蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品中，是重要的植物病原體。異細交鏈孢菌酮酸(ITeA)作為其主要的次級代謝產(chǎn)物之一，與細交鏈孢菌酮酸(TeA)同屬于四氨基酸衍生物，極易溶于甲醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜等有機溶劑，在石油醚等低極性的溶劑中溶解性差。研究表明，異細交鏈孢菌酮酸具有細胞毒性作用，能抑制氨基酸的結合，阻止蛋白質和DNA合成。據(jù)調查，鏈格孢菌最常污染小麥、高粱、大麥、葵花籽油、菜籽、番茄、蘋果、柑橘類和橄欖等，在高粱嬰兒谷物食品中檢測到ITeA的含量達75±8μg/kg，茴香茶中含量達21±14μg/kg，高粱糖果中含量達64±5μg/kg。目前文獻報道的真菌毒素的檢測方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、色譜與質譜聯(lián)用技術等儀器方法。然而，由于其操作復雜，耗時長，因此較難滿足大批量樣品的現(xiàn)場篩選需求，而免疫分析法因成本低、操作簡單、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低，值得我們推廣成為常用的篩選方法。化學發(fā)光免疫分析方法是將發(fā)光物質標記到抗原或抗體上，與抗體或抗原發(fā)生特異性免疫反應后，通過檢測標記物的化學發(fā)光強度確定被測抗體或抗原的含量，其靈敏度高，簡便快捷，可以用作現(xiàn)場大批量樣品的篩選。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術要解決的技術問題是克服現(xiàn)有異細交鏈孢菌酮酸類檢測技術的缺陷和不足，提供一種異細交鏈孢菌酮酸化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，所述試劑盒準確、靈敏、快速、能夠高通量檢測異細交鏈孢菌酮酸。本專利技術的另一目的在于提供上述試劑盒的使用方法。本專利技術的上述目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的。一種異細交鏈孢菌酮酸的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包含以下成分：(1)包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發(fā)光酶標板，所述的異細交鏈孢菌酮包被原濃度為15.6ng/mL，所述化學發(fā)光酶標板為可拆不透明白色發(fā)光板；(2)異細交鏈孢菌酮酸抗體；(3)酶標抗抗體；(4)異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液，濃度為1mg/mL；(5)化學發(fā)光液；(6)濃縮洗滌液；所述異細交鏈孢菌酮酸抗原是半抗原ITeAHGA(化學名為3-(1-腙基乙基)-4-羥基-5異丁基-1H-吡咯-2(5H)-酮)與卵清蛋白(OVA)共價偶聯(lián)合成得到的偶聯(lián)物；ITeAH的結構式如下所示：其中ITeAHGA的制備方法參考申請?zhí)枮?01310747570.2的專利。優(yōu)選地，所述化學發(fā)光酶標板是96孔或40孔可拆不透明酶標板，材質為聚苯乙烯，包被有能與抗異細交鏈孢菌酮酸抗體特異性結合的異細交鏈孢菌酮酸抗原，并封閉微孔表面未吸附異細交鏈孢菌酮酸抗原的位點。所述包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發(fā)光酶標板的制備方法為：用包被液將異細交鏈孢菌酮酸抗原按需要稀釋，向發(fā)光板微孔中加入包被液，放入37℃環(huán)境進行孵育過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37℃孵育，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。另外，可以作為固定異細交鏈孢菌酮酸抗原固相載體的物質較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡萄糖、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以為凹孔、紙片、小珠等。優(yōu)選地，所述包被異細交鏈孢菌酮酸抗原的包被液為按比例將1.69g碳酸鈉和2.95g碳酸氫鈉溶于1L雙蒸水中得到，異細交鏈孢菌酮酸抗原的包被濃度為0.167ug/L。優(yōu)選地，所述封閉液為將0.1gBSA(牛血清白蛋白)、5g甘氨酸、5g蔗糖溶于100mLPBS(0.01mol/LpH7.4)溶液得到。優(yōu)選地，所述異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液在使用時用0.01mol/L、pH5.4的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)將標準品溶液稀釋成濃度為0.0μg/L、0.00512μg/L、0.0256μg/L、0.128μg/L、0.64μg/L、3.2μg/L、16μg/L的一系列異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液。優(yōu)選地，所述磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)的配方為：NaH2PO4·12H2O2.9g、NaCl8.5g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、500μlTween-20，定容至1L。優(yōu)選地，所述化學發(fā)光液由A液和B液組成，A液和B液按體積比為1:1；A液的配方為：將對碘苯酚、魯米諾、Tris溶于去離子水，pH為8.2～8.6；B液的配方為：將體積分數(shù)0.40％的H2O2、Tris溶于去離子水，pH為6.8～7.2。更優(yōu)選地，A液pH為8.4，B液pH為7.0。優(yōu)選地，所述濃縮洗滌液為含有體積濃度0.5％Tween-20的pH7.40.4mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮洗滌液為20倍濃縮洗滌液，使用時用去離子水稀釋成1倍洗滌液。本專利技術還提供所述的異細交鏈孢菌酮酸化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，包含如下步驟：S1.將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于15～35℃平衡30min～45min；將所述異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋成一系列的濃度梯度；S2.取出化學發(fā)光酶標板，往標準孔中加入不同濃度的異細交鏈孢菌酮酸溶液，樣品孔中加入待測樣品，然后每孔加入異細交鏈孢菌酮酸抗體，蓋上蓋板膜振搖混勻，孵育；S3.吸除板孔中的反應液，用洗滌液進行洗滌，將酶標板拍干；所述洗滌液為濃縮洗滌液稀釋20倍得到；S4.往各孔中加入酶標抗抗體，輕拍混勻，孵育；S5.每孔加入化學發(fā)光液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，1～2min后測定各孔的發(fā)光值RLU；S6.檢測結果的計算與分析：確定樣品中異細交鏈孢菌酮酸的含量。抑制率(％)＝B/B0×100(％)，式中：B為不同濃度異細交鏈孢菌酮酸的標準品溶液孔或待測樣品孔的發(fā)光值；B0為0濃度異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標，異細交鏈孢菌酮酸的濃度的對數(shù)為橫坐標繪制標準曲線，從而確定樣品中異細交鏈孢菌酮酸的的含量。優(yōu)選地，S2所述的待測樣品為啤酒、果汁、番茄醬或大米。待測樣品前處理方法如下：啤酒、果汁樣本處理：量取1mL樣品于離心管中，除空白組外其他組直接添加ITeA標準品。加入2mL×2氯仿振蕩萃取以4000r/min離心10min，有機相加入100μL98％水合肼，振蕩反應30min后，減壓蒸干溶劑，殘余物用lmLH2O復溶。番茄醬處理：稱取1g已勻漿的番茄醬樣品于離心管中，除空白組外其它組直接添加不同濃度水平的ITeA，加入1mL飽和NaCl溶液，混勻后加入2mL×2氯仿振蕩萃取，以4000r/min離心10min，有機相加入100uL98％水合肼，振蕩反應30min后，減壓蒸干溶劑，lmLH2O復溶。本專利技術方法應用以下原理：本專利技術采用間接競爭化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法(ic-CLIA)，設計了使用該方法檢測異細交鏈孢菌酮酸的試劑盒，彌補了現(xiàn)有技術的缺點。化學發(fā)光免疫分析是將化學反光體系與免疫反應相結合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。其檢測原理是：(1)使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。(2)使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。(3)洗滌后加入發(fā)光底物，酶促使發(fā)光底物發(fā)光，通過專用的儀器檢測本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種異細交鏈孢菌酮酸的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，包含以下成分：（1）包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發(fā)光酶標板，所述的異細交鏈孢菌酮包被原濃度為15.6ng/?mL，所述化學發(fā)光酶標板為可拆不透明白色發(fā)光板；（2）異細交鏈孢菌酮酸抗體；（3）酶標抗抗體；（4）異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液，濃度為1mg/mL；（5）化學發(fā)光液；（6）濃縮洗滌液；所述的異細交鏈孢菌酮酸抗原為3?（1?腙基乙基）?4?羥基?5?異丁基?1H?吡咯?2（5H?酮）與卵清蛋白的偶聯(lián)物。

【技術特征摘要】
1.一種異細交鏈孢菌酮酸的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，包含以下成分：（1）包被有異細交鏈孢菌酮酸抗原的化學發(fā)光酶標板，所述的異細交鏈孢菌酮包被原濃度為15.6ng/mL，所述化學發(fā)光酶標板為可拆不透明白色發(fā)光板；（2）異細交鏈孢菌酮酸抗體；（3）酶標抗抗體；（4）異細交鏈孢菌酮酸標準品溶液，濃度為1mg/mL；（5）化學發(fā)光液；（6）濃縮洗滌液；所述的異細交鏈孢菌酮酸抗原為3-（1-腙基乙基）-4-羥基-5-異丁基-1H-吡咯-2（5H-酮）與卵清蛋白的偶聯(lián)物。2.根據(jù)權利要求1所述的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光液由A液和B液組成，A液和B液按體積比為1：1；A液的配方為：將對碘苯酚、魯米諾、Tris溶于去離子水，pH為8.2～8.6；B液的配方為：將體積分數(shù)0.40%的H2O2、Tris溶于去離子水，pH為6.8～7.2。3.根據(jù)權利要求1所述的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：沈玉棟，王弘，朱帆，肖治理，楊金易，孫遠明，徐振林，雷紅濤，
申請(專利權)人：華南農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44