脂肪組織凍存液及脂肪組織凍存方法技術

本發明專利技術涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種脂肪組織凍存液及脂肪組織凍存方法。所述凍存液含有體積百分數為4％～6％的二甲基亞砜、質量百分數為0.5％～10％的羥乙基淀粉以及質量百分數為10％～20％的人血白蛋白。所述凍存方法包括：1)、對脂肪組織樣本清洗后將其移入裝有緩沖液的離心管中離心；2)、將脂肪組織移至新的離心管內并剪成碎塊，加緩沖液并離心；3)、將脂肪組織移出并與預冷的脂肪組織凍存液混合得到混合液，將所述混合液冷凍后移入液氮中保存。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫藥
，具體地涉及一種脂肪組織凍存液及脂肪組織凍存方法。
技術介紹
間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是干細胞家族的重要成員，源于發育早期的中胚層和外胚層。間充質干細胞是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，屬于非終末分化細胞，它既有間質細胞，又有內皮細胞及上皮細胞的特征。間充質干細胞在體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經、肝、心肌、胰島β細胞和內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。間充質干細胞分布廣泛，被證實能夠從多種組織中分離得到。由于間充質干細胞具有增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于規模化制備等特征，故被認為是細胞治療中最有前景的一個方向。在臨床上，MSCs目前被用于研究各種疾病，包括：移植物抗宿主病、心肌梗死、克羅恩病、多發性硬化、系統系紅斑狼瘡、肝硬化等，取得了良好的效果。此外，間充質干細胞還具有支持造血和促進造血干細胞植入的功用。因此，間充質干細胞為一些難治性疾病的治療提供了全新的方案，在醫學史上具有里程碑意義。脂肪干細胞(adipose-derivedstemcells，ASCs)又稱脂肪來源間充質干細胞，首次由Zuk等在2001年從人類脂肪組織中分離出來，這群細胞具備多向分化潛能和穩定的增殖能力，且外形特征與間充質干細胞相符。因其具備取材容易、獲得率高，創傷小和不存在倫理學爭議等優勢，近些年成為諸多學者的研究熱點。脂肪干細胞目前已被證實能夠向成骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞以及神經元分化，多項動物疾病模型療效試驗充分證實其在潛在的臨床應用價值。此外，脂肪干細胞在整形美容方面應用廣泛，如隆胸、乳房整形、面部年輕化、以及皺紋和瘢痕修復等，是組織工程和再生醫學重要的種子細胞來源。采用合適的方法凍存脂肪組織，并在組織復蘇后從中獲取活性良好的脂肪干細胞，將為其在臨床應用上奠定基礎。因此本領域迫切需要開發新穎有效的且適合脂肪組織的凍存方法。有鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
本專利技術確定了一種新可臨床用脂肪組織的長期凍存方法：以供體脂肪為原料，通過脂肪樣本預處理、長期組織凍存充質干細胞的方法。此法具有易于操作、可規模化、不受時間限制等優點，做到“一次吸脂、多次使用”、不限組織和細胞、更豐富用途、利于臨床多種需求。與現有的直接分離脂肪間充質干細胞并進行細胞凍存更為簡便，同時可以節約成本和避免在實驗室長期培養帶來的微生物污染和細胞分化等風險。為了實現本專利技術的上述目的，特采用以下技術方案：一種脂肪組織凍存液，所述凍存液含有體積百分數為4％～6％的二甲基亞砜、質量百分數為0.5％～10％的羥乙基淀粉以及質量百分數為10％～20％的人血白蛋白。本專利技術將具有細胞毒性但目前尚無法替代的滲透性保護劑二甲基亞砜(DMSO)的濃度大幅度的降低，從傳統的10％最低降至5％，再佐以其他大分子非滲透性保護劑如羥乙基淀粉、人血白蛋白制成可直接用于保存臨床軟組織工程用脂肪組織的凍存液。該細胞制劑中的成分DMSO為臨床級且濃度較低，通過洗滌后將最大程度的避免對人體的毒副作用，故而能夠確保該冷凍保護劑保存的脂肪組織用于人體是絕對安全的。優選的，如上所述的脂肪組織凍存液，所述凍存液含有體積百分數為4％～6％的二甲基亞砜、質量百分數為3.5％～7％的羥乙基淀粉以及質量百分數為13％～17％的人血白蛋白。優選的，如上所述的脂肪組織凍存液，所述凍存液的溶劑為復方電解質注射液；所述復方電解質注射液含有氯化鈉5.26±0.4g/L、葡萄糖酸鈉5.02±0.4g/L、三水醋酸鈉3.68±0.3g/L、氯化鉀0.37±0.05g/L、六水氯化鎂0.30±0.05g/L。一種脂肪組織凍存方法，包括如下步驟：1)、對脂肪組織樣本清洗后將其移入裝有緩沖液的離心管中離心；2)、將脂肪組織移至新的離心管內并剪成碎塊，加緩沖液并離心；3)、將脂肪組織移出并與預冷的脂肪組織凍存液混合得到混合液，將所述混合液冷凍后移入液氮中保存。脂肪組織由一系列復雜的細胞群組成，包括成熟的脂肪細胞，前體脂肪細胞，纖維細胞，動脈平滑肌細胞，內皮細胞和脂肪間充質干細胞。脂肪組織不僅能夠為生物醫學再生領域和細胞治療提供大量所需的干細胞，同時還能夠直接作為自體移植物用于外科整形。早在上世紀80年代末，自體脂肪移植就逐漸得到外科醫生的認可并用于臨床。脂肪移植雖是一種較為理想的軟組織缺損填充手段，但通常移植后脂肪組織體積只能保持在移植時的50％左右，且移植成活率較低。因此，臨床上仍需要通過少量、反復、多次移植來達到滿意的填充效果。如果能實現一次抽取足夠量的脂肪并進行冷凍保存，在需要時復蘇，則會減輕對患者多次抽脂造成的痛苦。目前關于脂肪組織低溫凍存劑的研究較少，而最佳冷凍保存條件對臨床應用也具有重要的研究價值。使用無異源成分的凍存保護劑更符合未來往臨床方向延伸的目標。目前脂肪方面的應用技術主要包括細胞提取及凍存，鮮有脂肪組織凍存。本專利技術聯合使用滲透性保護劑和非滲透性保護劑，以保持凍存過的脂肪組織的細胞活力和生物學功能。優選的，所述緩沖液為生理鹽水、PBS或TBS。優選的，如上所述的脂肪組織凍存方法，所述脂肪組織樣本為新鮮樣本或冷藏保存的樣本；所述冷藏保存的樣本保存溫度為0℃～4℃，保存時間≤48h。優選的，如上所述的脂肪組織凍存方法，在步驟1)和步驟2)中，所述離心的條件為2800rpm～3200rpm離心5min～10min。離心后，脂肪組織中的油脂會懸于表層，每次離心后都需要把表層油脂吸去，隨后再將脂肪組織轉移到新的離心管或容器中進行操作，剩余液體和紅細胞隨離心管廢棄，這是為了避免離心管內壁的油脂和其他細胞對脂肪組織的污染。優選的，如上所述的脂肪組織凍存方法，在步驟2)中，碎塊的大小為0.1mm3～2mm3。優選的，如上所述的脂肪組織凍存方法，在步驟3)中，脂肪組織與預冷的脂肪組織凍存液混合的體積比為(1～2)：(1～2)。優選的，如上所述的脂肪組織凍存方法，所述預冷的脂肪組織凍存液的溫度為0℃～4℃。優選的，如上所述的脂肪組織凍存方法，在步驟3)中，將所述混合液冷凍后移入液氮中保存的操作具體包括：將所述混合液裝于凍存管內，將所述凍存管在0℃～5℃下平衡10min～30min，然后轉入-80℃凍存2h～16h，最后轉入液氮保存。優選的，凍存管在0℃～5℃下平衡10min～30min的操作在裝有新鮮異丙醇的程序降溫盒中進行。慢凍是為了防止降溫過快導致細胞內外水迅速結晶化，導致細胞結構破壞、蛋白質變性、pH改變等不良后果，進而對細胞造成損害。慢凍還能使細胞緩慢失水，減少胞內結晶的形成從而保護細胞。本專利技術主要提供了一種臨床用脂肪組織長期凍存方法，能夠保持脂肪組織的生物活性不發生改變，同時也可在復蘇后進行脂肪干細胞的分離擴增，甚至洗滌后直接進行軟組織填充等外科手術的臨床需求。其中我們將具有細胞毒性但目前尚無法替代的滲透性保護DMSO的濃度大幅度的降低，從傳統的10％最低降至5％，再佐以其他大分子非滲透性保護劑如羥乙基淀粉、人血白蛋白和復方電解質注射液制成可直接用于臨床軟組織工程的脂肪組織。該細胞制劑中的成分DMSO為臨床級且濃度較低，通本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種脂肪組織凍存液，其特征在于，所述凍存液含有體積百分數為4％～6％的二甲基亞砜、質量百分數為0.5％～10％的羥乙基淀粉以及質量百分數為10％～20％的人血白蛋白。

【技術特征摘要】
1.一種脂肪組織凍存液，其特征在于，所述凍存液含有體積百分數為4％～6％的二甲基亞砜、質量百分數為0.5％～10％的羥乙基淀粉以及質量百分數為10％～20％的人血白蛋白。2.根據權利要求1所述的脂肪組織凍存液，其特征在于，所述凍存液含有體積百分數為4％～6％的二甲基亞砜、質量百分數為3.5％～7％的羥乙基淀粉以及質量百分數為13％～17％的人血白蛋白。3.根據權利要求1或2所述的脂肪組織凍存液，其特征在于，所述凍存液的溶劑為復方電解質注射液；所述復方電解質注射液含有氯化鈉5.26±0.4g/L、葡萄糖酸鈉5.02±0.4g/L、三水醋酸鈉3.68±0.3g/L、氯化鉀0.37±0.05g/L、六水氯化鎂0.30±0.05g/L。4.一種脂肪組織凍存方法，其特征在于，包括如下步驟：1)、對脂肪組織樣本清洗后將其移入裝有緩沖液的離心管中離心；2)、將脂肪組織移至新的離心管內并剪成碎塊，加緩沖液并離心；3)、將脂肪組織移出并與預冷的脂肪組織凍存液混合得到混合液，將所述混合液冷凍后移入液氮中保存。5.根據權利要求4所述的脂肪組織凍存方法，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：杜小春，陳茜，戴玲華，
申請(專利權)人：杭州易文賽生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33