用于產生具有特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞的方法以及其用途技術

本發明專利技術涉及用于產生具有特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞(tolDC)的方法，該方法包括下列步驟：(a)使用細胞因子IL?4和GM?CSF，在無動物血清的培養基中培養樹突狀細胞的前體，以使其分化為樹突狀細胞；(b)產生凋亡細胞；(c)在具有抗炎活性的化合物存在下培養在步驟(a)中所獲得的樹突狀細胞；(d)共培養步驟(c)的樹突狀細胞與步驟(b)的凋亡細胞，以便促進所述樹突狀細胞對所述凋亡細胞的胞吞；(e)以及，通過借助于基于表型評價的鑒定來確定具有特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞(tolDC)的產生。本發明專利技術還涉及通過所述方法產生的tolDC細胞，以及所述具有特異性抗原的tolDC在制備適用于治療系統性紅斑狼瘡的藥物中的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
本專利技術涉及為在自身免疫性疾病中使用，特別是為治療系統性紅斑狼瘡(SLE)而設計的對于特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞的產生。現有技術系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種未知病因學的慢性自身免疫性疾病，其主要影響育齡女性，具有每100000人124例的患病率。從臨床的角度，狼瘡影響多個器官，包括尤其是腎臟、心臟、肺、皮膚和肌肉骨骼和血液系統。此外，它呈現以具有緩解期的交替再激活或爆發為特征的不可預測的臨床演變。雖然SLE的死亡率在最近50年中已顯著地降低，但是在20歲的年齡發展了SLE的患者具有15％的在35歲年齡死亡的概率，由于狼瘡本身或相關的并發癥。此外，SLE具有重大的聚集性發病率。作為例子，就對于患者的存活和生活質量的影響而言最相關的并發癥為狼瘡性腎炎(LN)，其影響直至50％的具有狼瘡的患者。盡管為優化該表現的治療進行了重大努力，但仍然有10-30％患有LN的患者發展到終末期腎功能不全并因此需要透析和/或腎移植。同樣，患有狼瘡的患者具有是一般人群2至5倍之間的死亡率，具有直至23％的工作能力喪失和在處于生育年齡的女性的情況下，這伴隨有懷孕困難和比健康女性在懷孕期間更高的發病率-死亡率。同樣，2011年FDA在30年來首次批準了用于SLE治療的新藥(belimumab)。然而，該藥物和其余在該疾病中通常使用的藥物，包括霉酚酸酯(MMF)、環磷酰胺和類固醇，是與重大的并發癥諸如機會性感染相關的非治療性治療和非特異性免疫抑制劑。最近，研究MMF在狼瘡性腎炎中的使用的ALMS計劃(NCT00377637)的研究小組發表了該試驗的維持期的結果，其中比較了在研藥物與硫唑嘌呤。結果中突出了，33.3％的使用硫唑嘌呤的患者和23.5％的使用MMF的患者具有嚴重的不良事件，其分別導致39.6％和25.2％的患者退出研究。其他為在其他自身免疫性病理學狀況中使用而批準的生物試劑諸如利妥昔單抗，在狼瘡的受控臨床研究中未顯示效力并且，與傳統的免疫抑制劑一樣，還可以有助于機會性感染的出現。本專利技術在于用于獲得用于SLE免疫療法的、特異于源自凋亡細胞的抗原的自體樹突狀細胞(DC)的方法。在現有技術的探索中，找到了與用于免疫性疾病治療的樹突狀細胞的獲得和使用相關的文獻。最接近在研技術的文獻為專利申請WO2001085207，其中提出使用凋亡細胞以通過T細胞無能的誘導來降低DC刺激細胞應答的能力。此外，包括各種用于調節通過DC的凋亡抗原呈遞的備選方案和DC的促成熟因子的用途。在該情況下，凋亡細胞是在樹突狀細胞的功能中行使調節作用的細胞。未在任何部分提到凋亡細胞與系統性紅斑狼瘡的關系。在本專利技術中，使用凋亡細胞的目的是不同的，本身不是尋求促進DC功能的調節并且不是關于能夠誘導T細胞無能的凋亡抗原如何由DC呈遞。使用凋亡細胞的目的是實現，本專利技術的DC特異于僅調節T細胞對于在系統性紅斑狼瘡的病理學中具有突出作用的包含在凋亡細胞中的抗原的應答。不僅如此，在所進行的實驗期間評價了，凋亡細胞不誘導DC的成熟，即不增加其免疫原能力，因為調節DC的免疫原性從未在使用的目的中。DC的功能調節通過使用羅格列酮(RGZ)和地塞米松(DEXA)來取得。等人的出版物“InductionofTolerogenicDendriticCellsbyNF-κBBlockadeandFcgReceptorModulation”描述了用羅格列酮和穿心蓮內酯處理的DC用于多發性硬化癥鼠模型的治療的用途并暗示可以用于其他自身免疫性疾病例如其中不知抗原的狼瘡。制定了用于直接用這些藥物治療動物和用于用羅格列酮和穿心蓮內酯產生致耐受性DC(tolDC)的實驗方案。在本專利技術中，提出了一起使用羅格列酮和穿心蓮內酯以產生致耐受性DC，這在等人的出版物中沒有出現。此外，在所述出版物中，提出了直接用NF-κΒ抑制藥物羅格列酮和穿心蓮內酯，不用如在本專利技術中提出的用這些藥物處理的DC，來治療小鼠。用經處理的DC的治療在多發性硬化癥模型中進行。對用致耐受性DC治療SLE的可能性的唯一提及是細微的并且從未包括包含凋亡細胞以誘導識別源自這些細胞的抗原的T淋巴細胞的無能這樣的想法。不僅如此，特別地提到狼瘡抗原是未知的，從未提出可以使用凋亡細胞作為抗原的來源。甚至這表現為一個潛在的障礙。國際專利申請出版物WO2012160200提出了類固醇和維生素D用于產生具有致耐受特性的成熟DC的用途。與類固醇的孵育時間是4天并且按原文說“為了獲得成熟DC”。然后，將這些細胞在促炎性細胞因子的環境中培養，其中對成熟DC通過表面CD14的存在和對致耐受性細胞通過MERTK表達來鑒定。在本專利技術中，提出使用地塞米松(糖皮質激素)和羅格列酮(噻唑烷二酮)獲得未成熟DC(iDC)，這在該專利申請中未提到并且其不是與維生素D相似的。本專利技術的方法是不同的，因為將其與羅格列酮和地塞米松一起孵育。在該文獻的任何部分都未暗示或提出DC應當通過用某些特異性抗原處理而具有給定的特異性。不僅如此，未在任何部分暗示在SLE的情況下，抗原的來源可以是凋亡細胞的使用。本專利技術的DC為CD14(-),即不表達它并且不評價MERTK的存在，因此是來源于不同方法學的不同產物。為了產生基于DC的免疫療法，抗原特異性是突出的，因為該類型療法的優點之一是減少針對自身抗原的應答而不影響針對外來抗原的有效應答。然而，目前使SLE免疫療法的發展變得復雜的主要障礙之一是不了解負責疾病發展的特異性自身抗原。由于具有狼瘡的患者在消除凋亡過程中所產生的細胞殘留物中具有缺陷，因此已假定這些可以是自身抗原的來源。為此，本專利技術提出使用凋亡細胞作為自身抗原的來源以使致耐受性DC(tolDC)的活性專門朝向自身反應性淋巴細胞(圖1)。附圖描述圖1.樹突狀細胞的表型。具有低免疫原性潛力的未成熟細胞在促炎刺激物諸如LPS的存在下成熟，獲得具有增高的活化T淋巴細胞的能力和表面標志物CD80、CD83、CD86和CD40的表達增加這樣的表型。但是，當未成熟細胞接受抗炎刺激物時，它們可以轉變為致耐受性細胞，其誘導T淋巴細胞中的耐受性而沒有變為免疫原性潛力。圖2.用于產生用凋亡細胞脈沖刺激的未成熟樹突狀細胞(iDC)和致耐受性樹突狀細胞(tolDC)的實驗設計。圖3：使用UV-B輻射產生凋亡細胞。A：未暴露于UV-B光的淋巴細胞的代表性散點圖(基礎)。B：用星形孢菌素(Novex,Carlsbed,CA,USA)(1μΜ)處理24小時(+凋亡對照)。C：在56℃處理50分鐘的(+壞死對照)。D：暴露于UV-B輻射1.5小時。E：在對照個體暴露于UV-B輻射1.5小時后用PI和Anex-V-FITC處理的淋巴細胞的百分比分布/象限。圖4.用于測定DC內吞凋亡細胞的能力的實驗設計。圖5：凋亡細胞并入單核細胞衍生的DC的流式細胞術分析。A：細胞自身熒光的直方圖和CD11c+群體的測定。B：用于對于CFSE陽性信號(FITC+)的測定的直方圖。C：對照個體的CD11c+群體。D：從來自對照個體的細胞中的CD11c+群體開始獲得的FITC+群體的直方圖。圖6：在自體凋亡細胞存在下凋亡細胞被來自SLE患者的單核細胞衍生的DC內吞的共聚焦顯微術。在該圖的左圖中，觀察到用結合至活細胞的高爾基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
產生具有特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞(tolDC)的方法，其包括下列步驟：(a)使用細胞因子IL?4和GM?CSF，在無動物血清的培養基中培養樹突狀細胞的前體，以使其分化為樹突狀細胞；(b)產生凋亡細胞；(c)在具有抗炎活性的化合物存在下培養在步驟(a)中所獲得的樹突狀細胞；(d)共培養步驟(c)的樹突狀細胞和步驟(b)的凋亡細胞，以便促進樹突狀細胞對凋亡細胞的胞吞；(e)通過借助于表型鑒定的鑒定來確定具有特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞(tolDC)的獲得。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.05 US 62/008,3191.產生具有特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞(tolDC)的方法，其包括下列步驟：(a)使用細胞因子IL-4和GM-CSF，在無動物血清的培養基中培養樹突狀細胞的前體，以使其分化為樹突狀細胞；(b)產生凋亡細胞；(c)在具有抗炎活性的化合物存在下培養在步驟(a)中所獲得的樹突狀細胞；(d)共培養步驟(c)的樹突狀細胞和步驟(b)的凋亡細胞，以便促進樹突狀細胞對凋亡細胞的胞吞；(e)通過借助于表型鑒定的鑒定來確定具有特異性抗原的致耐受性樹突狀細胞(tolDC)的獲得。2.根據權利要求1的方法，其中步驟a)的樹突狀細胞的前體選自單核細胞、骨髓祖細胞，或者直接來自外周血或臍帶血。3.根據權利要求1的方法，其中當在30至45℃之間和在1至10％的CO2之間的條件下培養前體和細胞因子IL-4和GM-CSF時進行分化。4.根據權利要求1的方法，其中步驟b)的凋亡細胞在使細胞暴露于選自以下的凋亡刺激時產生：B類型紫外(UV-B)輻射；選自星形孢菌素、氨甲喋呤的化學物質的存在；特異性受體的活化例如Fas-Fas配體相互作用或用七氯或魚藤酮的線粒體電子運輸抑制。5.根據權利要求1的方法，其中凋亡細胞所源自的細胞為血液細胞、肌細胞、表皮細胞、上皮細胞、干細胞或人細胞系。6.根據權利要求5的方法，其中血液細胞為外周血淋巴細胞、血小板、嗜中性粒細胞或單核細胞。7.根據權利要求1的方法，其中步驟c)的在具有抗炎活性的化合物存在下培養樹突狀細胞是在5至48小時的時期內進行的。8.根據權利要求7的方法，其中具有抗炎活性的化合物選自羅格列酮(RGZ)和地塞米松(DEXA)或其組合。9.根據權利要求8的方法，其中將樹突狀細胞在5至30μΜ的羅格列酮存在下和0.5至5μΜ的地塞米松存在下進行培養。10.根據權利要求1的方法，其中步驟d)的共培養樹突狀細胞和凋亡細胞是考慮5至20μg/ml的表達為DNA含量的凋亡細胞的量的情況下進行的。11.根據權利要求10的方法，其中共培養是在無動物血清的培養基中完成的。12.根據權利要求1的方法，其中共培養樹突狀細胞和凋亡細胞是在5至48小時的時期內完成的。13.根據權利要求1的方法，其中在步驟e)中，tolDC的鑒定是通過評價以下方面完成的：(i)相比于免疫原性成熟DC而言應當降低的細胞因子IL-6和IL-12p70的產生；和(ii)相比于免疫原性成熟DC而言表面標志物的缺乏或降低的表達，其中所述表面標志物選自CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR或其組合。14...

【專利技術屬性】
技術研發人員：C·利亞諾斯穆尼奧斯，A·M·卡萊伊斯帕拉，F·A·維加塔皮亞，A·I·托里斯巴埃薩，
申請(專利權)人：智利天主教教皇大學，
類型：發明
國別省市：智利;CL