水溶性可活化分子探針、其合成中間體及相關檢測方法技術

本發明專利技術涉及式(I)的探針，及其生理學上可接受的鹽、溶劑化物或水合物；其中：X1＝NH、O或S；X2＝O或S；SE是不穩定基團，其可以在刺激作用下被除去，該刺激可以特別是存在酶、化學化合物或含有該探針的介質的物理化學特性；A是芳香基，其在水溶液中在C(X2)?O鍵裂解后釋放發色團或熒光團；R是氫原子或?(L)n?GP，其中n等于0或1，L是連接臂，GP是水溶性基團。本發明專利技術的主題還涉及其合成中間體和使用其的檢測方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及在診斷領域中使用的可活化分子探針，其包含響應刺激而自降解(self-immolate)以釋放可檢測熒光團或發色團型實體的連接臂，該刺激可以特別是存在酶、化學化合物或探針環境的物理化學特性。檢測酶活性可廣泛用于生物樣品或化學樣品的分析。整個生物體、細胞或細胞提取物、生物液體或化學混合物是其中可以檢測酶活性的生物樣品或化學樣品的實例。多種疾病的許多生物標志由酶構成。它們還參與許多細胞過程，因此已經成為細胞生物學家進行許多研究的焦點。因此，例如，它們的檢測能夠提供關于特定代謝或發病狀況的信息。出于這一原因，能夠檢測酶活性的探針是非常有用的，并且已經成為很多研究的焦點。具體而言，可以提到本專利申請的專利技術人之一的工作，其對應于涉及肽酶底物的申請WO2013/045854和涉及糖苷酶底物的申請WO2014/020285，兩者均使用將關注的酶的底物鍵合到芳基的自降解連接體，在底物裂解之后，連接體環化并釋放激發態分子內質子轉移(ESIPT)熒光團。然而，響應酶活性的分子探針的良好水溶性是保證它們提供可靠結果的基本標準之一。具體而言，加入有機共溶劑以溶解疏水分子一般而言大幅度降低了酶的活性。此外，雖然一些體外測試可以接受使用低濃度的溶液，但向細胞孵育或體內全身性注射的轉變則需要使用濃度高很多的溶液，因為它們在注射后在很大程度上被稀釋。此外，體內不能夠使用共溶劑。最后，疏水性太強的分子具有在脂肪組織而非靶組織中積累的風險。因此，化學家們已經關注溶解度的問題很長時間，并且已開發出許多解決方案。首先是摻入具有鹽特征的基團作為酶底物。該方案在例如遇到磷酸酶探針(Hauglandetal.Anal.Biochem.1992,207,32)或caspase-3探針(Liuetal.J.Am.Chem.Soc.2012,134,17972)時非常好地起作用，但是其限制了設想的酶的選擇，因為不能夠靶向識別非極性底物的酶。此外，帶負電荷的分子通過細胞膜存在困難，因此該應用被限于靶向胞外酶。第二方案是將水溶性基團接枝到所使用的信號團(signalophore)上，通常是磺酸酯基(Tungetal.Tetrahedron2006,62,578；Shabatetal.J.Am.Chem.Soc.2011,133,10960)。這里再次說明，通過這些基序提供的水溶作用是優異的，但是這一措施不太具有吸引力，因為其一旦在酶活性后使信號團從初始探針釋放則就有降低信號團性能的風險。此外，當將要使用固態信號團時，不能夠簡單地展望該類型的方案。因此，這兩種可能性不能夠推廣到大量的響應酶活性的分子探針。目前，僅有非常少的幾種系統能夠提供水溶性物質與酶底物以釋放旋光性分子為目的的通用締合。這些通常是基于取代的消除連接體(Shabatetal.J.Am.Chem.Soc.2008,130,5434)或基于環化連接體與消除連接體的組合(Shabatetal.Bioorg.Med.Chem.2007,15,7318)。問題是已知取代的消除連接體產生高毒性的反應中間體(Rokita,QuinoneMethides,1sted.2009,JohnWileyandSonsInc.；Boltonetal.Chem.Res.Toxicol.1995,8,323；Thatcheretal.J.Org.Chem.1997,62,1820)。另外，環化/消除組合是遠非理想的，因為其更加復雜(必須連續使用兩種連接體)，同時證明了降解動力學是遠非令人滿意的(Wuetal.Bioorg.Med.Chem.2012,20,3465)，或者在面對不可忽略的自發水解時是不穩定的(RomieuetalOrg.Lett.2008,10,1517)。某些構建體在數十小時內遞送它們的活性分子(Shabatetal.BioconjugateChem.2006,17,1432)，使得它們難以在快速檢測給定樣品中是否存在某些分析物中使用。因此，期望開發新一代的環化連接體，其能夠用于以通用的且滿足溶解度要求的方式并入任何酶底物，無論該酶底物是極性的或是非極性的。然而，這一連接體必須保留快速的降解動力學，并且必須允許有效的酶識別。在本專利技術的上下文中，專利技術人提出了新一代的探針，由于存在哌嗪基團，其中一個氮原子能夠攜帶多種水溶性基團，該探針能夠提供令人滿意的水溶性，并且還易于合成和修飾。專利技術人選擇提出的方案是在探針的第三組件上(即在連接信號團和底物的連接體中)并入水溶性部分，這意味著可以選擇任何期望的酶底物和任何期望的報道分子。根據本專利技術的探針具有式(I)：其中-X1＝NH、O或S；-X2＝O或S；-SE是不穩定基團，特別是酶底物；-A是芳香基，其在水溶液中在C(X2)-O鍵裂解后釋放發色團或熒光團；-R表示氫原子或-(L)n-GP，且n等于0或1；-L是連接臂；且-GP是水溶性基團；以及它們的生理學上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。本專利技術可以用于通過檢測具有下式的哌嗪基型連接體環化之后釋放的發色團或熒光團，進而檢測能夠裂解X1-SE鍵的化學或酶分析物：根據本專利技術的底物用作能夠揭示刺激(如酶、化學化合物或探針所在介質的物理化學特性(特別是pH的改變))存在的分子探針。當探針通過所述刺激化學修飾時，其通過級聯反應的方式形成碎片以釋放可檢測的發色團或熒光團。也可能是當基團A連接到式(I)的探針中分子的剩余部分時，基團A充當發色團或熒光團。關于“比率型(ratiometric)”探針，它們的光譜性質，特別是吸光度和/或熒光性質不同于在刺激(如酶、化學化合物或探針所在介質的物理化學特性)的作用下釋放的實體。有利地但不是必須地，可以以使得式(I)的探針在遇到刺激(特別是酶、化學化合物或探針所在介質的物理化學特性的形式)之前不能通過光的吸收或發射檢測的(即探針被稱為“隱秘的(furtive)”)方式選擇基團A。不穩定基團SE是如下基團：其例如由酶途徑或在純化學作用(如pH變化或存在還原劑)下連續的消除通過自降解連接體的分子內重排確保了熒光團或發色團的釋放，特別是以A-OH或A-O-，或A'＝O的形式(A'＝O是在A-OH重排之后獲得的形式，A-OH的互變異構形式或聚合形式)。SE-X1鍵的裂解通過以下方案1所示的連接體的環化觸發了熒光團或發色團的釋放，特別為A-OH或A-O-，或A'＝O(A'＝O是在A-OH或A-O-重排之后獲得的形式，A-OH的互變異構形式或聚合形式)：方案1探針由四個分子組件組成：i)在一端攜帶的智能連接體，ii)不穩定基團SE，以及在另一端的iii)經由連接體的氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯基團鍵合的有機基團A-O，當其通過使連接體-A-O偶聯物形成碎片來釋放以提供相應的烯醇或烯醇化物化合物時，其導致可檢測的發色團或熒光團的形成，以及iv)水溶性基團。在本專利技術的上下文中，攜帶基團R的氮原子的存在意味著探針的性質能夠被修飾，并且在不穩定基團SE和基團A側能夠引入第三官能團，在基團SE釋放和連接體環化之后釋放可檢測的發色團或熒光團。事實上，根據本專利技術的式(I)的探針包括能夠用于并入多種選擇的酶底物的可多官能化的哌嗪型連接體，以及伴隨的基團R，該伴隨的基團R依據其性質能夠用于賦予分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
式(I)的探針，以及它們的生理學上可接受的鹽、溶劑化物或水合物：其中：?X1＝NH、O或S；?X2＝O或S；?SE是不穩定基團，其在水溶液中能夠通過刺激作用被消除，該刺激可以特別是存在酶、化學化合物或探針所在介質的物理化學特性；?A是芳香基，其在水溶液中在C(X2)?O鍵裂解后釋放發色團或熒光團；?R表示氫原子或?(L)n?GP，且n等于0或1；?L是連接臂；且?GP是水溶性基團。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.26 FR 14560141.式(I)的探針，以及它們的生理學上可接受的鹽、溶劑化物或水合物：其中：-X1＝NH、O或S；-X2＝O或S；-SE是不穩定基團，其在水溶液中能夠通過刺激作用被消除，該刺激可以特別是存在酶、化學化合物或探針所在介質的物理化學特性；-A是芳香基，其在水溶液中在C(X2)-O鍵裂解后釋放發色團或熒光團；-R表示氫原子或-(L)n-GP，且n等于0或1；-L是連接臂；且-GP是水溶性基團。2.根據權利要求1所述的探針，其特征在于所述不穩定基團SE是酶底物。3.根據權利要求1所述的探針，其特征在于：·X1是氧，且SE是酯酶、糖苷酶、磷酸酶、硫酸酯酶或葡糖醛酸酶底物，或X1-SE形成能夠在酸性介質中裂解的縮醛鍵；·或X1表示NH，且SE是蛋白酶或轉移酶底物；·或X1是硫，且X1-SE是能夠被還原劑裂解的二硫橋。4.根據權利要求1至3中任一項所述的探針，其特征在于所述不穩定基團SE是選自以下的至少一種酶的底物：酯酶，如羧酸酯酶，或脂酶；堿性磷酸酶；葡糖醛酸酶，如β-葡糖醛酸酶；糖苷酶；蛋白酶，如金屬蛋白酶；肽酶；和酰胺酶。5.根據權利要求1至4中任一項所述的探針，其特征在于SE選自經由其異頭碳鍵合到分子的剩余部分的糖基；和經由其末端碳或側鏈攜帶的酰基官能團鍵合到分子的剩余部分的肽基。6.根據權利要求1至5中任一項所述的探針，其特征在于SE是糖苷酶底物，例如N-乙酰基-β-氨基半乳糖苷酶；N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶；α-淀粉酶；α-阿拉伯呋喃糖苷酶；α-阿拉伯糖苷酶；β-纖維二糖苷酶；β-殼二糖苷酶；α-半乳糖苷酶；β-半乳糖苷酶；α-葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；β-葡糖醛酸酶；α-麥芽糖苷酶；α-甘露糖苷酶；β-甘露糖苷酶；β-木糖苷酶；β-D-巖藻糖苷酶；α-L-巖藻糖苷酶；β-L-巖藻糖苷酶；L-艾杜糖醛酸酶；或纖維素酶；且對應于經由其異頭碳鍵合到分子的剩余部分的糖基，并且特別是，SE是單糖基化基團，選自半乳糖基、葡萄糖基、甘露糖基、古洛糖基、阿洛糖基、阿卓糖基、艾杜糖基、塔羅糖基、巖藻糖基、果糖基、阿拉伯糖基、來蘇糖基、核糖基、木糖基、葡糖醛酸基和N-乙酰基-氨基己糖基；或多糖基化基團，其由多個，例如2至20個，優選3至10個，更特別是4至6個相同或不同的所述單糖基化基團組成。7.根據權利要求1至5中任一項所述的探針，其特征在于SE是以下酶的底物：半乳糖苷酶特別是β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、葡糖苷酶、N-乙酰基-D-氨基葡糖苷酶、N-乙酰基-D-氨基半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、巖藻糖苷酶或葡糖醛酸酶特別是β-葡糖醛酸酶；并且對應于經由其異頭碳鍵合到分子的剩余部分的糖基化基團，并且特別地，SE是單糖基化基團，選自D-葡糖醛酸基、L-艾杜糖醛酸基、D-吡喃葡萄糖基、D-半乳吡喃糖基、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖基、N-乙酰基-D-氨基半乳糖基、D-吡喃甘露糖基、L-吡喃巖藻糖基，或多糖基化基團，其由多個，例如2至20個，優選地3至10個，更特別是4至6個可以相同或不同的所述單糖基化基團組成。8.根據權利要求1至5中任一項所述的探針，其特征在于SE是：·蛋白酶或肽酶的底物，特別是組織蛋白酶或金屬蛋白酶的底物，特別是PSMA(前列腺特異性膜抗原)；且SE對應于經由其末端碳或側鏈攜帶的酰基官能團鍵合到分子的剩余部分的肽基或氨基酸基團；·或轉移酶底物，特別是谷胱甘肽轉移酶或γ-谷氨酰轉移酶的底物，且SE對應于經由其末端碳或側鏈攜帶的酰基官能團鍵合到分子的剩余部分的肽基或氨基酸基團，或SE對應于與X1形成磺酰胺的磺酰基，其中X1表示NH。9.根據權利要求1至8中任一項所述的探針，其特征在于A是包含一個或多個可以任選地被取代的芳香環的芳香化合物，所述環可能包含一個或多個選自氮、氧或硫原子的雜原子和/或一個或多個羰基C＝O形式的碳原子。10.根據權利要求1至9中任一項所述的探針，其特征在于A是釋放發色團的芳香化合物，所述發色團選自對硝基苯酚及其衍生物、靛類染料、環己烯并七葉內酯、茜素和羥基黃酮。11.根據權利要求1至9中任一項所述的探針，其特征在于A是芳香化合物，其中-OA選自：12.根據權利要求1至9中任一項所述的探針，其特征在于A是芳香化合物，其中-OA具有式(AA)：其中：·X5是氧原子，且X4是-NH2、-OH、-SH、烷基、芳基、-O-烷基、-O-苯基、-NH-烷基、-NH-苯基、-S-烷基或-S-芳基，所述烷基和苯基可能是取代的或未取代的；或·X5表示氮原子，并且與X4鍵合以形成取代的或未取代的雜芳基，X4表示CH、O、S、N或NH；并且表示芳基或雜芳基，其可以是取代的或未取代的，例如選自苯基和萘基，和：所述基團可能是取代的或未取代的；其中X6表示S、O或NR\，并且R\表示氫原子或(C1-C4)烷基；·-OA基團優選地是苯氧基類型，并且對應于以下優選的結構(BB)或(CC)：*其中·T是-NH-C(O)-、-S-、-O-、-NH、N-烷基或N-芳基；·Ra是氫或吸電子含碳取代基，如-CN或-COORd，其中Rd表示(C1-C4)烷基，或者Ra是-CONReRf，其中Re和Rf可以是相同或不同的，表示氫或(C1-C4)烷基，或者Ra是-CF3或2-唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉酮-2-基；·Rb是氫、氯、溴、碘或氟原子、-OH、-NH2、-NRgRh、-NHRg或-ORg，其中Rg和Rh各自獨立地表示(C1-C4)烷基；·或者Ra和Rb鍵合在一起以形成含有4或5個鍵的烴鏈，其可以是飽和或不飽和的、取代的或未取代的，任選地被一個或多個選自N、S和O的雜原子中斷；·Rc是氫、Br、Cl、I或F；*其中：·T'是NH2、OH、芳基、(C1-C4)烷基、SH、NHR'c、OR'c、NR'cR'd或SR'c基團，其中R'c和R'd可以相同或不同，表示(C1-C4)烷基或芳基；·R'a是氫或吸電子含碳取代基，如-CN或-COOR'e，其中R'e表示(C1-C4)烷基，或者R'a是-CONR'fR'g，其中R'f和R'g可以相同或不同，表示氫或(C1-C4)烷基，或者R'a是-CF3或2-唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉酮-2-基；·R'b是氫、氯、溴、碘或氟原子、-OH、-NH2、-NR'hR'i或-OR'h，其中R'h和R'i可以相同或不同，表示(C1-C4)烷基；·或者R'a和R'b鍵合在一起以形成含有4或5個鍵的烴鏈，其可以是飽和的或不飽和的、取代的或未取代的，任選地被一個或多個選自N、S和O的雜原子中斷。13.根據權利要求1至9中任一項所述的探針，其特征在于A是芳香化合物，其中-OA具有下式之一：14.根據權利要求1至13中任一項所述的探針，其特征在于R表示-(L)n-GP，其中n＝1，且L是連接臂，并且特別是-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J·阿斯羅特，M·普羅斯特，
申請(專利權)人：里昂高等師范學院，克洛德·貝納爾里昂第一大學，國家科學研究中心，
類型：發明
國別省市：法國;FR