一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌OsiLf-2制造技術

本發明專利技術公開了一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌Streptomyces?hydrogenans?OsiLf?2，菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC?No.11673。該菌體外能對至少5種不同生理小種的稻瘟病菌有很好的拮抗作用。其發酵液也具有較強的拮抗稻瘟病菌能力，而且抗菌活性很穩定。該菌或其發酵液在生物防治水稻稻瘟病、開發新型安全無毒的綠色農藥等方面具有較大的應用潛力。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物內生放線菌與生物防治領域，具體涉及一株具有拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌的分離及抗性相關研究。
技術介紹
水稻稻瘟病是指由稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）引起的一種水稻真菌病害。稻瘟病菌生存能力很強及傳播廣泛的特點，使其成為對水稻危害最為嚴重的病害之一。目前對稻瘟病的防治主要包括抗病品種選育和藥劑防治。但是長期大量使用化學農藥，污染環境，損害人類健康，還導致病原菌產生抗藥性。稻瘟病菌的遺傳背景復雜且易變異，使得水稻抗病品種難以跟上致病菌生理小種的變異速度，在3-5年后就喪失抗病性。而采用以農業可持續化發展為宗旨的生物防治方法，利用有益微生物及其代謝產物控制稻瘟病菌，相對來說更加安全高效。內生菌是可以在其整個或部分生長周期中穩定定殖在植物內部的微生物菌群。與根際和土壤微生物相比，內生菌生長在植物內部而不會與土壤菌產生生存競爭。而且，內生菌在長期的協同進化過程中，與植物形成了互利互惠的關系。它可以直接抵抗病菌的侵染或通過促進寄主植物的生長或誘發免疫反應來間接提高植物抗病性。目前報到的用于稻瘟病生物防治的抗病性內生菌大多是易培養的細菌和真菌類群，較難分離的內生放線菌則報道較少。但放線菌作為抗生素的主要來源，其生防潛能更大。
技術實現思路
本專利技術提供了一株具有防治稻瘟病潛力的水稻內生放線菌OsiLf-2，該菌株分離自稻瘟病發病區的水稻葉部，已于2015年11月16日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）保藏（保藏地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號），保藏號為CGMCCNo.11673，分類命名為產水鏈霉菌Streptomyceshydrogenans，專利技術人將其命名為OsiLf-2，經檢測存活。該菌16sRNA的Genbank登錄號為KU350524。本專利技術所得菌株生長能力較強，易于培養。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）上生長時，氣生菌絲黃白色，呈放射狀生長，分枝較多，不產生可溶性色素。掃描電鏡觀察發現其孢子呈連續棒狀結構。該菌株在pH為6.0-12.0和溫度為20℃-40℃環境中均可良好生長；能使淀粉水解，酪蛋白水解，明膠液化，能產生過氧化氫酶；能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、半乳糖、甘露醇、柳醇。專利技術所得菌株能對至少5種不同生理小種的稻瘟病菌有較好拮抗作用，能明顯抑制菌絲生長，其對稻瘟病菌生長抑制率最高達83%。專利技術所得菌株發酵液有較好的抗稻瘟病菌活性，培養溫度為35℃或培養基pH為7的發酵液抗稻瘟病菌活性較好。當其生長量達到最大時，其發酵液的抗稻瘟病菌能力也基本達到最強，其后隨著培養時間的增加，抗性也能保持穩定。發酵液用蛋白酶K、低溫、強光照和紫外處理一個小時仍然保持完整的活性；100℃處理一個小時仍然保留了大部分的活性；強酸和強堿處理一個小時，也能保持較好的抗菌活性。上述特征表明本專利技術提供的內生放線菌OsiLf-2，具有較強的抗真菌活性，且其抗菌成分藥效持久、穩定，在生物防治水稻稻瘟病和開發新型、高效的農用新藥物等方面具有較大的開發潛力。附圖說明圖1：本專利技術菌株OsiLf-2的菌落形態圖（A）及掃描電子顯微鏡觀察圖（B）；圖2：本專利技術菌株OsiLf-2的系統進化樹；圖3：本專利技術菌株OsiLf-2對5種不同生理小種稻瘟病菌的抑制情況，A-E.稻瘟病菌對照；F-J.OsiLf-2對5種不同生理小種的稻瘟病菌的抑制；圖4：稻瘟病菌RB3在掃描電子顯微鏡下，未經OsiLf-2處理（A）和經OsiLf-2處理的（B）菌絲體形態；圖5：本專利技術菌株OsiLf-2在不同培養條件下的生長量及抗稻瘟病菌活性（A.不同培養時間；B.不同培養基pH；C.不同培養溫度）。具體實施方式實施例1：OsiLf-2菌株的分離、純化和篩選取湖南亞華種業科學研究院瀏陽大圍山基地易感秈稻品種，將發病不嚴重的葉片洗凈，植物表面消毒，干燥后置于甘露醇大豆瓊脂培養基（MS）上，置于27℃培養，待內生放線菌長出，再結合劃線分離法在固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上獲得其純培養物。采用平板對峙法，將分離得到的菌株與稻瘟病菌同時接種到PDA固體平板上，放入霉菌培養箱中28℃倒置培養，每天觀察，篩選出拮抗真菌效果最明顯的菌株OsiLf-2，其對稻瘟病菌菌絲抑制率最高達83%，見附圖3。實施例2：OsiLf-2菌株的生物學鑒定1．菌株形態特征（1）菌落形態特征：將OsiLf-2單菌落劃線接種至PDA固體培養基中，將平板倒置于恒溫培養箱，28℃培養，3天以內長出無色基生菌絲和氣生菌絲，菌落表面平滑、邊緣呈褶皺。3天后長出黃白色白色孢子覆蓋在菌落上。見附圖1A。（2）菌體形態特征：用插片法培養該菌，在電子顯微鏡下觀察其氣生菌絲及孢子情況，見附圖1B。2.OsiLf-2菌株16SrRNA分析采用革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒（ShanghaiGenerayBiotechCo.,Ltd）的方法，抽提菌株基因組DNA，以該DNA為模板，采用放線菌16SrRNA基因引物（27F-765R及704F-1492R），擴增出菌株的16SrRNA片段并測序，將得到的16SrRNA序列與Eztaxon的核酸數據庫進行Blast同源性比對(http://www.ezbiocloud.net)，與數據庫中已知放線菌Streptomyceshydrogenans的16SrRNA全長序列的相似性達到了100%，保守區序列的相似性達到100%，將該菌株鑒定為鏈霉菌屬，命名為產水鏈霉菌StreptomyceshydrogenansOsiLf-2。使用軟件MEGA5.0采用鄰近結合法（neighbor-joiningmethod）制作OsiLf-2的系統進化樹，見附圖2。實施例3：OsiLf-2菌株對不同生理小種稻瘟病菌的抑制采用平板對峙法，在直徑為90mm的培養皿中心接種不同生理小種稻瘟病菌。其中RB3，61，62，SO7來自湖南亞華種子有限公司，Guy11來自湖南省農業科學院。刮取活化好的OsiLf-2在距離病原真菌30mm的位置上劃一直線。28℃倒置培養7天以上，結果見附圖3，OsiLf-2對稻瘟病菌RB3、61、62、Guy11、SO7的抑制率分別為74.1%、74.6%、82.9%、83.0%、80.6%。實施例4：OsiLf-2菌株對稻瘟病菌RB3菌絲體的影響取平板對峙實驗中接近放線菌邊緣和對照組中相對應位置的稻瘟病菌RB3菌塊，經過戊二醛和鋨酸固定后，洗脫干燥處理并噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察菌絲體的形態變化，結果見附圖4，可見經OsiLf-2處理后的稻瘟病菌RB3的菌絲體出現了明顯的畸形和菌絲斷裂。實施例5：OsiLf-2菌株在不同培養條件下的生長情況及其發酵液抗稻瘟病活性采用菌絲生長速率法測定菌株的生長情況。將OsiLf-2接種至酵母麥芽提取物液體培養基（ISP2）中，在28℃，150r/min震蕩培養條件下培養10天，每天取出一定量的菌液，8000rpm離心10min取出上清液，菌體烘干至恒重并稱重。上清液經0.22um無菌過濾膜過濾后按10%的比例加入PDA培養基中，混合均勻倒置平板并接種稻瘟病真菌，28℃倒置培養7天以上。檢測不同培養條件對菌株生長和發酵液的抗稻瘟病活性的影響，皆采用I本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌，所述水稻內生放線菌為產水鏈霉菌（Streptomyces?hydrogenans），保藏號為CGMCC?No.?11673。

【技術特征摘要】
1.一株體外高效拮抗稻瘟病菌的水稻內生放線菌，所述水稻內生放線菌為產水鏈霉菌（Streptomyceshydrogenans），保藏號為CGMCC...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱詠華，劉選明，曾夏冬，廖紅東，劉雨晴，徐婷，袁珊珊，高艷，
申請(專利權)人：湖南大學，
類型：發明
國別省市：湖南;43