干涉片段及其應用制造技術

本發明專利技術公開了干涉片段及其應用，其中該干涉片段的作用靶點為如下所示的核苷酸序列：5′-GCCACCATTGTCTTTCCTAGC-3′(SEQ?ID?NO：10)。該干涉片段針對上述靶點靶向性好，對PD-1的干涉抑制效果突出，并且，將上述干涉片段轉入免疫細胞，能夠使該免疫細胞PD-1的表達受到長期抑制，得到PD-1表達抑制的免疫細胞，并且該細胞進入人體后獲得的增殖細胞PD1的表達也被抑制，進而獲得的PD-1表達抑制的免疫細胞能夠有效用于制備免疫治療藥物，進而用于腫瘤的免疫治療，從而能夠有效提高免疫治療效果，降低副作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫生物學
，具體涉及干涉片段及其應用。
技術介紹
惡性腫瘤是人類主要的致死性疾病類型，死亡率居高不下。衛生部最新統計數據表明惡性腫瘤居我國居民前十位死因首位。2010年中國惡性腫瘤發病患者268萬人，死亡197萬人；目前全國共有惡性腫瘤患者600余萬人。每年用于惡性腫瘤病人的醫療費用約占衛生總費用的20％，是全社會最大的醫療負擔。目前的治療手段對于達到治愈、延長惡性腫瘤患者生存期以及改善生活質量等目標的作用仍然十分有限，尤其對于某些類型的惡性腫瘤即使是早期診斷也難以獲得滿意的療效，至于轉移性、全身性或進展期的惡性腫瘤則更難以治愈。目前的腫瘤治療策略中，手術和放療等局部治療對局限性腫瘤有較好的療效，而對于全身性、轉移性或局部治療后的微小殘留病灶則主要依靠化療或免疫療法進行系統性治療。腫瘤發病是多步驟、多基因作用的結果，腫瘤細胞表現出生長、分化與凋亡的失控。臨床上病人癥狀的多樣性和個體遺傳異質性，以及腫瘤遠處轉移病灶的出現，使腫瘤治療必須以全身性疾病的觀點，采用個體化的綜合治療方案。即根據每個腫瘤病人的特點，采用局部治療結合全身治療；不僅要消除局部病灶的腫瘤，還要控制腫瘤的復發、轉移生長及腫瘤對重要臟器的侵襲，才能真正有效地提高腫瘤病人的治愈率和生存期。通常腫瘤局部病灶的治療可采取手術和物理治療(包括射頻消融、熱療、放療、冷凍、超聲波及激光治療等)方法消除，然而對于影像學不能發現的腫瘤微小病灶(如轉移復發灶、局部治療后的殘留病灶、血液中的癌細胞)，以上局部治療手段則無能為力，必須通過全身性治療手段加以解決。由于腫瘤的轉移、復發、擴散更為致命，因此全身性治療顯得尤為重要和緊迫。目前全身性治療有傳統化學治療、分子靶向藥物治療、生物治療(包括干細胞移植治療和免疫細胞治療)以及基因治療等。傳統化療雖然在某些腫瘤治療方面取得了一些進展，但對延長腫瘤病人生存期方面仍然貢獻不大。而且腫瘤細胞對化療藥的天然耐藥和獲得性多藥耐藥以及化療毒性，使化學治療的發展受到了嚴重的妨礙。多年來的臨床實踐證明它并非是全身治療的優勢項目。免疫細胞治療是近二十年發展起來的，由于它治療范圍廣(可用于實體腫瘤及白血病)，特別對腫瘤微小病灶(包括轉移、復發灶、血液中的癌細胞)更為有效，無毒副作用，而且適用于腫瘤各階段(如晚期放、化療不能使用)，因此它是全身治療的一個優勢項目。免疫細胞治療對提高生命質量、延長生存期有顯著的效果，倍受國內外推崇，是目前全身治療的最佳手段之一，臨床潛力巨大。程序性死亡因子1(programmedcelldeath-1,PD-1)是屬于共刺激分子28(costimulatorymolecule28,CD28)/細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxiclymphocyteassociatedantigen,CTLA-4)家族的抑制性受體。PD-1不但是程序性死亡細胞的標記，同時表達于B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK細胞、NKT細胞以及巨噬細胞表面。近年來研究更是發現，被抗原激活的T淋巴細胞表面會短暫地表達PD-1，而PD-1的持續表達可能會導致T細胞功能紊亂。PD-1表達的廣泛性和免疫抑制功能，使其成為近年來免疫治療的焦點。在癌癥、自身免疫病、慢性病毒感染等疾病的治療中，PD-1均起到了重要的作用。目前，主要PD-1的應用主要表現為開發特異性封閉PD-1信號的抗體，然后將此類抗體藥物用于晚期癌癥及轉移性癌癥的治療，雖然治療效果尚可，但也經常會有藥物相關的不良事件發生。因而，目前PD-1在免疫治療方面的應用仍有待改進。
技術實現思路
首先，需要說明的是，本專利技術是基于專利技術人的下列發現而完成的：將特異性封閉PD-1信號的抗體藥物用于晚期癌癥及轉移性癌癥的治療，雖然治療效果尚可，但藥物相關的不良事件(adverseevents,AEs)總發生率為41％，3/4級的嚴重藥物AEs為5％，主要包括：皮膚(16％)、胃腸道反應(12％)、肺部(7％)。藥物相關的肺炎發生率為(6％)，3級/4級肺炎發生率為2％(2/129)，試驗早期有2例患者因肺炎死亡。并且，部分病人對于抗體治療有應答，也有部分病人在接受抗體治療后其各項指標無明顯變化。有的病人在接受抗體治療后應答不完全，例如一位72歲多器官癌變的男性病患，在經過一個療程的治療后，胰臟的癌變轉移性明顯降低，但是其他位點癌變無明顯變化。有的病人對于抗體治療應答完全，發生腫瘤退化。此外，有的病例對于此抗體治療應答情況復雜，例如一位52歲的多處淋巴結核肝臟癌變的女性患者，在接受了抗體治療后，多處癌變衰退但是有一處淋巴結癌變增強。封閉PD-1信號通路的抗體不是直接作用于腫瘤組織而是通過激活抗腫瘤免疫發揮作用。由于免疫應答的復雜性以及個體差異，這些抗體的治療效果在不同類型的癌癥患者以及不同個體之間差異較大。如前所述，PD-1抑制劑(抗體)經過靜脈回輸后產生的副作用是存在的，同時系統性免疫疾病的病人不宜用該藥，因為PD-1抑制劑可以增強免疫細胞的殺傷能力，增加免疫反應，病情加重。也有部分病人抗體治療后應答不完全。本專利技術旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本專利技術的一個目的在于提出一種能夠有效抑制免疫細胞PD-1表達的手段，由此，通過抑制免疫細胞中PD-1的表達，進而將獲得的PD-1表達抑制的免疫細胞用于制備免疫治療藥物，并將該藥物用于腫瘤的免疫治療，從而能夠有效解決上述問題，提高PD-1在免疫治療中的應用范圍和應用效果。具體地，為了解決上述問題，本專利技術利用基因工程技術，成功構建了針對PD-1的shRNA的慢病毒載體，并篩選獲得了干擾效率超過90％的靶點序列；然后，基于篩選獲得的干擾靶點序列，通過攜帶相應干涉片段的pd-1shRNA慢病毒載體，將篩選的相應干涉片段轉入免疫細胞——T淋巴細胞(包括：CTL，TIL，CD8+T，NKT細胞等)，使其PD-1的表達受到長期抑制，得到PD-1表達抑制的免疫細胞，其中該細胞進入人體后獲得的增殖細胞PD1的表達也被抑制；進而，專利技術人將該類經過修飾的T細胞回輸人體或腫瘤局部，結果發現，能夠有效提高免疫治療效果，最大程度上降低了副作用。因而，根據本專利技術的一個方面，本專利技術提供了一種干涉片段。根據本專利技術的實施例，該干涉片段的作用靶點為如下所示的核苷酸序列：5′-GCCACCATTGTCTTTCCTAGC-3′(SEQIDNO：10)。專利技術人驚奇地發現，本專利技術的干涉片段針對上述靶點靶向性好，對PD-1的干涉抑制效果突出。并且，根據本專利技術的實施例，將上述干涉片段轉入免疫細胞——T淋巴細胞(例如CTL，TIL，CD8+T，NKT細胞等)，能夠使該免疫細胞PD-1的表達受到長期抑制，得到PD-1表達抑制的免疫細胞，并且該細胞進入人體后獲得的增殖細胞PD1的表達也被抑制，從而，該獲得的PD-1表達抑制的免疫細胞能夠有效用于制備免疫治療藥物，進而用于腫瘤的免疫治療，有效提高免疫治療效果，最大程度上降低了副作用。另外，根據本專利技術上述實施例的干涉片段還可以具有如下附加的技術特征：根據本專利技術的實施例，所述干涉片段由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成：正義鏈：5′-GATCCGCCACCATTGTCTTT本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種干涉片段，其作用靶點為如下所示的核苷酸序列：5′?GCCACCATTGTCTTTCCTAGC?3′(SEQ?ID?NO：10)。

【技術特征摘要】
1.一種干涉片段，其作用靶點為如下所示的核苷酸序列：5′-GCCACCATTGTCTTTCCTAGC-3′(SEQIDNO：10)。2.根據權利要求1所述的干涉片段，其特征在于，所述干涉片段由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成：正義鏈：5′-GATCCGCCACCATTGTCTTTCCTAGCTTCAAGAGAGCTAGGAAAGACAATGGTGGCTTTTTTG-3′(SEQIDNO：11)，反義鏈：5′-AATTCAAAAAAGCCACCATTGTCTTTCCTAGCTCTCTTGAAGCTAGGAAAGACAATGGTGGCG-3′(SEQIDNO：12)。3.一種抑制免疫細胞中PD-1表達的方法，其特征在于，包括：將權利要求1或2所述的干涉片段轉入所述免疫細胞。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，利用慢病毒載體系統將所述干涉片段轉入所述免疫細胞。5.根據權利要求3所述的方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊光華，
申請(專利權)人：楊光華，
類型：發明
國別省市：上海;31