一種磷酸化多肽的固相合成方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)一種磷酸化多肽的固相合成方法，包括以下具體步驟：選用2?Cl?Resin為起始載體，采用固相合成法，在活化劑和縮合劑的作用下，以Fmoc?保護(hù)氨基酸為縮合原料，依次縮合磷酸化多肽氨基酸序列中相對(duì)應(yīng)的氨基酸，得到磷酸化多肽?2?Cl?Resin；將磷酸化多肽?2?Cl?Resin進(jìn)行切割沉降反應(yīng)，純化并凍干，得到磷酸化多肽產(chǎn)品。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)采用Fmoc固相合成法，采用不同的活化劑和縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，以及采用不同的洗滌方法洗滌多肽樹(shù)脂，提高了縮合效率，經(jīng)切割沉降、純化得到磷酸化多肽產(chǎn)品。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了產(chǎn)品的收率，具有可觀(guān)的經(jīng)濟(jì)適用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于多肽產(chǎn)品合成制備的
，特別涉及一種磷酸化多肽的固相合成方法。
技術(shù)介紹
磷酸化多肽序列：TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC，分子量：2288.08。磷酸化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾，對(duì)蛋白質(zhì)功能的完成或改變起到重要作用。生命活動(dòng)與蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)，很多情況下某些蛋白質(zhì)的絕對(duì)量并不會(huì)發(fā)生明顯變化，而是通過(guò)各種翻譯后完成或改變其功能。在眾多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中，磷酸化修飾時(shí)非常重要的一種，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)中超過(guò)30％可被磷酸化修飾。然而異常的磷酸化也是引起諸多疾病的起因，尤其是突變的蛋白激酶、磷酸酶可導(dǎo)致許多紊亂，很多天然毒素和病原體也是通過(guò)改變胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)來(lái)發(fā)揮它們的影響。絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化作用是一個(gè)可逆的蛋白修飾過(guò)程，它們參與調(diào)節(jié)無(wú)數(shù)的細(xì)胞活動(dòng)，如受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)締合與分割、激活或抑制蛋白功能，甚至細(xì)胞的存活等。許多激素均是通過(guò)提高絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基的磷酸化狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)特異性酶的活性。傳統(tǒng)合成磷酸化多肽時(shí)需對(duì)磷酸根進(jìn)行保護(hù)，在整個(gè)多肽鏈合成完畢后再進(jìn)行脫保護(hù)，反應(yīng)工藝復(fù)雜，且磷酸化多肽產(chǎn)品收率較低。本專(zhuān)利技術(shù)提供一種改進(jìn)的磷酸化多肽合成方法，合成操作方便簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，便于磷酸化多肽的快速合成制備。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種磷酸化多肽的固相合成方法，該合成方法反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、成本低、具有生產(chǎn)磷酸化多肽產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用前景。本專(zhuān)利技術(shù)的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種磷酸化多肽的固相合成方法，該固相合成方法包括以下具體步驟：(1)選用2-Cl-Resin為起始載體，采用固相合成法，在活化劑和縮合劑的作用下，以Fmoc-保護(hù)氨基酸為縮合原料，依次縮合磷酸化多肽氨基酸序列中相對(duì)應(yīng)的氨基酸，得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin；(2)將磷酸化多肽-2-Cl-Resin進(jìn)行切割沉降反應(yīng)，純化并凍干，得到磷酸化多肽產(chǎn)品。所述的起始氨基樹(shù)脂為2-Cl-Resin，取代度為0.64mmol/g。步驟(1)中所述縮合反應(yīng)過(guò)程中以DIC/HOBT為活化劑和縮合劑，以DMF溶液洗滌多肽樹(shù)脂，反應(yīng)中氨基酸投料量為3倍所投樹(shù)脂摩爾數(shù)，縮合反應(yīng)時(shí)間為30-60min；以20％Pip/DMF溶液為脫保護(hù)劑，洗脫時(shí)間為20min。步驟(1)中所述縮合反應(yīng)過(guò)程中以HBTU/DIEA為縮合試劑，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗滌多肽樹(shù)脂。步驟(1)中所述Fmoc-保護(hù)氨基酸縮合順序依次為：Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Thr(HPO3Bzl)-OH、Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH，縮合反應(yīng)溫度為25℃。步驟(2)中所述切割試劑為T(mén)FA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2體積比，切割液體積為反應(yīng)器容積的1/2，樹(shù)脂切割兩次，將切割液分別吹入到冰乙醚中，離心沉淀去上清，重復(fù)操作3次。步驟(2)中所述純化方法指采用高效液相色譜法純化用C18色譜柱，以A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈為流動(dòng)相，以B.Cone/％(2→55)，Time/min(0→30)的梯度進(jìn)行多肽的分離提純，凍干得到磷酸化多肽產(chǎn)品。本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果：本專(zhuān)利技術(shù)采用Fmoc固相合成法，以2-ClResin為固相載體，在縮合反應(yīng)過(guò)程中采用不同的活化劑和縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，以及采用不同的洗滌方法洗滌多肽樹(shù)脂，提高了縮合效率，經(jīng)切割沉降、純化得到磷酸化多肽產(chǎn)品。本專(zhuān)利技術(shù)大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了產(chǎn)品的收率，具有可觀(guān)的經(jīng)濟(jì)適用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式通過(guò)下述實(shí)施例將有助于理解本專(zhuān)利技術(shù)，但不能限制本專(zhuān)利技術(shù)的內(nèi)容。對(duì)于本專(zhuān)利技術(shù)所屬
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本專(zhuān)利技術(shù)構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單替換或推演，都視為屬于本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍。實(shí)施例一磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成1.2-Cl-Resin的溶脹稱(chēng)量取代度為0.64mmol/g的2-Cl-Resin1g，從開(kāi)口端加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹(shù)脂完全浸沒(méi)在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹0.5h。2.磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成磷酸化多肽-2-Cl-Resin為：TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC-2-Cl-Resin本實(shí)施例使用的保護(hù)氨基酸從樹(shù)脂起算第1-18個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸及分子量如下表所示：本專(zhuān)利技術(shù)中一些常用的縮寫(xiě)具有以下含義：Fmoc：芴甲氧羰基Boc：叔丁氧羰基DMF：N,N-二甲基甲酰胺DCM：二氯甲烷Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰Pip：六氫吡啶TFA：三氟醋酸Trt：三苯甲基tBu：叔丁基otBu：氧叔丁基DIC：N,N-二異丙基碳化二亞胺DIEA：N,N-二異丙基乙胺HOBT：1-羥基苯并三唑(1)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的合成稱(chēng)取210mgFmoc-Cys(trt)-OH和230mgHOBT放于10ml離心管中，加5mlDCM將其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)1h。(2)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的封頭反應(yīng)配制甲醇：DIEA＝1:1(體積比)的混合液2ml，將其加入到抽干的反應(yīng)器中，置于20-30r/min的搖床上搖20min。(3)樹(shù)脂的洗滌方法用真空泵將反應(yīng)器中的脫保護(hù)溶液抽干，然后加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應(yīng)器中溶液再加入DMF洗滌，重復(fù)操作3次。(4)脫除Fmoc保護(hù)基加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20％哌啶/DMF脫保護(hù)溶液到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖晃反應(yīng)20min。(5)保護(hù)氨基酸的活化方法以Fmoc-Ser(tBu)-Cys(trt)-2-Cl-Resin的縮合為例，稱(chēng)取684mgFmoc-Ser(tBu)-OH和230mgHOBT放于10ml離心管中，加入5mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻得到活化的保護(hù)氨基酸溶液。(6)磷酸化氨基酸的縮合以HBTU/DIEA為縮合試劑加入到反應(yīng)器中，縮合反應(yīng)30-60min后，用DMF溶液洗滌樹(shù)脂，然后按照上述方法脫除磷酸化氨基酸的Fmoc保護(hù)基，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗滌樹(shù)脂1次，之后再以DMF溶液洗滌樹(shù)脂3次。(7)磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成將上述活化的保護(hù)氨基酸溶液加到抽干的反應(yīng)器中，再將反應(yīng)器置于25℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)30-60min，洗滌，脫保護(hù)，再洗滌。采用上述同樣方法，依次縮合第2-18個(gè)Fmoc-保護(hù)氨基酸，即得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin。實(shí)施例二磷酸化多本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，該固相合成方法包括以下具體步驟：(1)選用2?Cl?Resin為起始載體，采用固相合成法，在活化劑和縮合劑的作用下，以Fmoc?保護(hù)氨基酸為縮合原料，依次縮合磷酸化多肽氨基酸序列中相對(duì)應(yīng)的氨基酸，得到磷酸化多肽?2?Cl?Resin；(2)將磷酸化多肽?2?Cl?Resin進(jìn)行切割沉降反應(yīng)，純化并凍干，得到磷酸化多肽產(chǎn)品。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，該固相合成方法包括以下具體步驟：(1)選用2-Cl-Resin為起始載體，采用固相合成法，在活化劑和縮合劑的作用下，以Fmoc-保護(hù)氨基酸為縮合原料，依次縮合磷酸化多肽氨基酸序列中相對(duì)應(yīng)的氨基酸，得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin；(2)將磷酸化多肽-2-Cl-Resin進(jìn)行切割沉降反應(yīng)，純化并凍干，得到磷酸化多肽產(chǎn)品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，所述的起始氨基樹(shù)脂為2-Cl-Resin，取代度為0.64mmol/g。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(1)中所述縮合反應(yīng)過(guò)程中以DIC/HOBT為活化劑和縮合劑，以DMF溶液洗滌多肽樹(shù)脂，反應(yīng)中氨基酸投料量為3倍所投樹(shù)脂摩爾數(shù)，縮合反應(yīng)時(shí)間為30-60min；以20％Pip/DMF溶液為脫保護(hù)劑，洗脫時(shí)間為20min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(1)中所述縮合反應(yīng)過(guò)程中以HBTU/DIEA為縮合試劑，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗滌多肽樹(shù)脂。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳為光，孫良玉，張旭光，程曉紅，李凱，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：合肥國(guó)肽生物科技有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：安徽;34