利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種利用β?葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法及其應(yīng)用。該方法是在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種嗜熱厭氧梭菌，并添加物質(zhì)A進(jìn)行厭氧發(fā)酵，物質(zhì)A為β?葡萄糖苷酶和表面活性劑中的一種或兩種；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為以菇渣為碳源的培養(yǎng)基。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)能利用菇渣，變廢為寶；通過(guò)添加β?葡萄糖苷酶可以顯著提高氫氣的產(chǎn)量；共同添加β?葡萄糖苷酶和表面活性劑可以顯著提高還原糖的積累量和底物的利用率以及生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，是一種高效環(huán)境友好型的產(chǎn)氫和生物糖化耦合工藝，具有極其廣闊的應(yīng)用推廣前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
隨著人類(lèi)社會(huì)的進(jìn)步，作為人類(lèi)賴(lài)以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，能源的需求量也日益劇增。目前世界上的能源供應(yīng)大部分都是化石能源，但是由于其不可再生、儲(chǔ)量有限和環(huán)境污染問(wèn)題制約著人類(lèi)社會(huì)的進(jìn)步。能源和環(huán)境危機(jī)將可再生能源推向了研究熱潮，希望其可以替代化石能源，支撐人類(lèi)社會(huì)對(duì)能源的需求。以可木質(zhì)纖維素為原料，利用微生物或者其他手段將其轉(zhuǎn)化為可以直接利用的生物乙醇或者氫氣，由于可再生性和環(huán)境友好性被人們寄予厚望，受到眾多研究者的重視。實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高效轉(zhuǎn)化的第一步是將聚合形式的纖維素和半纖維素分解為可發(fā)酵性的糖，同時(shí)也是生物質(zhì)能源化的限速步驟，該過(guò)程通常利用纖維素酶進(jìn)行，但是由于酶的生產(chǎn)成本高，利用微生物直接轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素的方法受到大家的青睞。提高微生物的降解效率和轉(zhuǎn)化效率可以有效降低生物質(zhì)能源的生產(chǎn)成本，加速生物能源的工業(yè)化進(jìn)程。原材料和酶的成本在生物燃料生產(chǎn)中占據(jù)較大比重，因此如何選擇所使用的原材料和酶以降低生物燃料的成本是研究人員的研究方向。以農(nóng)業(yè)廢棄物——菇渣為原料，利用聯(lián)合加工工藝直接進(jìn)行微生物的轉(zhuǎn)化，可以大幅降低原料成本和酶的生產(chǎn)成本，同時(shí)還可以解決廢棄菇渣對(duì)環(huán)境的污染問(wèn)題，對(duì)生物燃料的生產(chǎn)具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法。該方法以菇渣為原料，僅僅通過(guò)洗滌粉碎等前期處理，利用嗜熱厭氧梭菌(Clostridiumthermocellum)厭氧發(fā)酵過(guò)程中添加β-葡萄糖苷酶和低濃度的表面活性劑提高菇渣的發(fā)酵產(chǎn)氫和生物糖化效率。本專(zhuān)利技術(shù)的另一目的在于提供所述利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖方法的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法，包括以下步驟：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種嗜熱厭氧梭菌，并添加物質(zhì)A進(jìn)行厭氧發(fā)酵，提高產(chǎn)氫和生物糖化效率；物質(zhì)A為β-葡萄糖苷酶和表面活性劑中的一種或兩種。所述的物質(zhì)A優(yōu)選為β-葡萄糖苷酶、或是β-葡萄糖苷酶和表面活性劑的組合。所述的表面活性劑優(yōu)選為T(mén)ritonX-100。所述的表面活性劑的濃度優(yōu)選為125g/L。所述的表面活性劑的添加時(shí)間優(yōu)選為發(fā)酵第82h添加。所述的表面活性劑的添加量?jī)?yōu)選為按終濃度為質(zhì)量(g)體積(ml)比0.25％計(jì)算。所述的表面活性劑優(yōu)選通過(guò)如下操作步驟得到：將表面活性劑溶液裝入能密封的容器中密封，抽真空、充惰性氣體及滅菌。所述的能密封的容器優(yōu)選為血清瓶。所述的惰性氣體優(yōu)選為氮?dú)狻Ｋ龅某涠栊詺怏w的具體操作優(yōu)選為：充0.01MPa氮?dú)?次。所述的滅菌的條件優(yōu)選為：115℃滅菌20min。所述的β-葡萄糖苷酶為嗜熱厭氧梭菌本身的β-葡萄糖苷酶。所述的β-葡萄糖苷酶的添加時(shí)間為：發(fā)酵第0h和/或發(fā)酵第82h時(shí)添加，優(yōu)選為0h添加后82h再補(bǔ)加一次。所述的β-葡萄糖苷酶的添加量?jī)?yōu)選為按1g菇渣配比10～11Uβ-葡萄糖苷酶計(jì)算；更優(yōu)選為每50mL厭氧發(fā)酵體系中含30Uβ-葡萄糖苷酶。所述的β-葡萄糖苷酶優(yōu)選通過(guò)如下制備方法制備得到：對(duì)嗜熱厭氧梭菌的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行克隆，再將該β-葡萄糖苷酶基因重組到表達(dá)載體中，將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，得到β-葡萄糖苷酶。所述的克隆的步驟優(yōu)選如下：以嗜熱厭氧梭菌的DNA或cDNA為模板，通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR，得到β-葡萄糖苷酶基因；引物1：5`-CAGTCCATGGCAAAGATAAC-3`；引物2：5`-CGAGCTCGAAACCGTTGTTTTTGATTAC-3`。所述的表達(dá)載體優(yōu)選為原核表達(dá)載體；更優(yōu)選為pET-30a載體。所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為原核宿主細(xì)胞；更優(yōu)選為大腸桿菌BL21。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為以菇渣為碳源的培養(yǎng)基。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為A液、B液、C液、D液和E液按體積比40：2：1：1：1混合得到，pH值約為7.0，其中：A液中含有60g/L的菇渣作為碳源；B液中含有檸檬酸鉀50g/L、一水檸檬酸31.25g/L、硫酸鈉25g/L、磷酸二氫鉀25g/L和碳酸氫鈉62.5g/L；C液中含有氯化銨75g/L、尿素250g/L和酵母抽提物50g/L；D液中含有六水氯化鎂50g/L、氯化亞鐵四水合物5g/L、二水氯化鈣10g/L和L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物50g/L；E液中含有二鹽酸吡哆胺1g/L、對(duì)氨基苯甲酸0.2g/L、D-生物素0.1g/L、維生素B120.1g/L和維生素B10.2g/L；A液、B液、C液、D液、和E液中的溶劑為去離子水。所述的菇渣優(yōu)選通過(guò)如下方法制備得到：將菇類(lèi)生產(chǎn)后的廢棄物用清水洗滌至中性后烘干至恒重，粉碎得到，菇類(lèi)生產(chǎn)后的廢棄物包括菇類(lèi)的培養(yǎng)基以及被廢棄的菇體。所述的粉碎的程度為能過(guò)200目篩。所述的嗜熱厭氧梭菌為能夠直接降解纖維素的嗜熱厭氧梭菌，優(yōu)選為嗜熱厭氧梭菌ATCC27405。所述的嗜熱厭氧梭菌為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱厭氧梭菌，接種體積量?jī)?yōu)選為相當(dāng)于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％。所述的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱厭氧梭菌通過(guò)如下步驟制備得到：將嗜熱厭氧梭菌在種子液培養(yǎng)基中經(jīng)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱厭氧梭菌。所述的種子液培養(yǎng)基組成為：A1液、B液、C液、D液和E液按體積比40：2：1：1：1混合得到，其中：A1液中含有3g/L的纖維素作為碳源；B液中含有檸檬酸鉀50g/L、一水檸檬酸31.25g/L、硫酸鈉25g/L、磷酸二氫鉀25g/L和碳酸氫鈉62.5g/L；C液中含有氯化銨75g/L、尿素250g/L和酵母抽提物50g/L；D液中含有六水氯化鎂50g/L、氯化亞鐵四水合物5g/L、二水氯化鈣10g/L和L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物50g/L；E液中含有二鹽酸吡哆胺1g/L、對(duì)氨基苯甲酸0.2g/L、D-生物素0.1g/L、維生素B120.1g/L和維生素B10.2g/L；A1液、B液、C液、D液、和E液中的溶劑為去離子水。所述的活化的條件優(yōu)選為：在西林瓶中加入種子液培養(yǎng)基，再接種嗜熱厭氧梭菌，于55～60℃搖床培養(yǎng)48～72h。所述的放大的條件優(yōu)選為：在血清瓶中加入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72h，再接種經(jīng)活化后的嗜熱厭氧梭菌，于55～60℃搖床培養(yǎng)48～72h或OD600＝1.1～1.3。所述的厭氧發(fā)酵優(yōu)選通過(guò)如下操作步驟實(shí)現(xiàn)：在能密封的發(fā)酵容器中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，密封，抽真空，充惰性氣體，滅菌，再接種嗜熱厭氧梭菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵。所述的發(fā)酵的溫度優(yōu)選為55℃，搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為150rpm，發(fā)酵的時(shí)間優(yōu)選為168h收集氫氣或發(fā)酵液。所述的能密封的容器優(yōu)選為血清瓶。所述的惰性氣體優(yōu)選為氮?dú)狻Ｋ龅某涠栊詺怏w的具體操作優(yōu)選為：充0.01MPa氮?dú)?次。所述的滅菌的條件優(yōu)選為：115℃滅菌20min。所述的利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法在微生物發(fā)酵領(lǐng)域中的應(yīng)用。所述的微生物發(fā)酵領(lǐng)域中的應(yīng)用是指嗜熱厭氧梭菌轉(zhuǎn)化菇渣、甘蔗渣中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)本專(zhuān)利技術(shù)發(fā)酵使用的原料為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)后的廢棄物——菇渣，具有較高的總纖維素(纖本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用β?葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法，其特征在于包括以下步驟：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種嗜熱厭氧梭菌，并添加物質(zhì)A進(jìn)行厭氧發(fā)酵，物質(zhì)A為β?葡萄糖苷酶和表面活性劑中的一種或兩種；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為以菇渣為碳源的培養(yǎng)基。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法，其特征在于包括以下步驟：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種嗜熱厭氧梭菌，并添加物質(zhì)A進(jìn)行厭氧發(fā)酵，物質(zhì)A為β-葡萄糖苷酶和表面活性劑中的一種或兩種；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為以菇渣為碳源的培養(yǎng)基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法，其特征在于：所述的表面活性劑為T(mén)ritonX-100；所述的表面活性劑的添加量按終濃度為質(zhì)量體積比0.25％計(jì)算；所述的β-葡萄糖苷酶的添加量按每g菇渣配比10～11Uβ-葡萄糖苷酶計(jì)算。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法，其特征在于：所述的表面活性劑的添加時(shí)間為發(fā)酵第82h添加；所述的β-葡萄糖苷酶的添加時(shí)間為：發(fā)酵第0h和/或發(fā)酵第82h時(shí)添加。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法，其特征在于：所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為A液、B液、C液、D液和E液按體積比40：2：1：1：1混合得到，pH值約為7.0，其中：A液中含有60g/L的菇渣作為碳源；B液中含有檸檬酸鉀50g/L、一水檸檬酸31.25g/L、硫酸鈉25g/L、磷酸二氫鉀25g/L和碳酸氫鈉62.5g/L；C液中含有氯化銨75g/L、尿素250g/L和酵母抽提物50g/L；D液中含有六水氯化鎂50g/L、氯化亞鐵四水合物5g/L、二水氯化鈣10g/L和L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物50g/L；E液中含有二鹽酸吡哆胺1g/L、對(duì)氨基苯甲酸0.2g/L、D-生物素0.1g/L、維生素B120.1g/L和維生素B10.2g/L；A液、B液、C液、D液、和E液中的溶劑為去離子水。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用β-葡萄糖苷酶提高菇渣產(chǎn)氫和產(chǎn)糖的方法，其特征在于：所述的菇渣通過(guò)如下方法制備得到：將菇類(lèi)生產(chǎn)后的廢棄物用清水洗滌至中性后烘干至恒重，粉碎得到，菇類(lèi)生產(chǎn)后的廢棄物包括菇類(lèi)的培養(yǎng)基以及被廢棄的菇體。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用β-葡萄糖...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱明軍，胡彬彬，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：華南理工大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44