一種維持DC?CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑制造技術

本發明專利技術公開了一種維持DC?CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑，所述凍存保護劑由RPMI1640、胎牛血清和二甲基亞砜、太子參環肽B或C組成；RPMI?1640、胎牛血清和二甲基亞砜按照體積比6:3:1混合；所述太子參環肽B的濃度為7?9μg/ml；所述太子參環肽C的濃度為4?6μg/ml。本發明專利技術凍存保護劑能在保證DC?CIK細胞凍存復蘇率的基礎上最大限度維持DC?CIK細胞的高殺傷力，延續miRNA?155低表達所帶來的強殺傷力。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于免疫領域，涉及DC-CIK細胞的培養，具體涉及一種維持DC-CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑。
技術介紹
申請人于2016年12月22日提交了一件DC-CIK細胞培養的專利申請，該申請公開了miRNA-155及其抑制劑在DC-CIK細胞培養方面的應用，miRNA-155可以作為藥物靶標在提高DC細胞共培養增強的CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷力中的應用。該申請的說明書公開了miRNA-155下調表達的DC-CIK細胞比miRNA-155正常表達的DC-CIK細胞具有更高的殺傷力，而miRNA-155下調表達的DC細胞與miRNA-155正常表達的DC細胞的殺傷力基本一致，無顯著性差異。這表明，miRNA-155下調并不能直接提高DC細胞對白血病細胞的殺傷力，但是miRNA-155下調的DC細胞可以通過共培養顯著增強CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷力。申請人還發現，太子參環肽B和太子參環肽C為miRNA-155的有效抑制劑。出于實驗需要，研究人員通常需要將細胞進行凍存，以便日后復蘇使用。申請人發現，miRNA-155低表達的DC-CIK細胞在凍存前雖然對白血病細胞的殺傷力非常高，但是，凍存復蘇后殺傷力明顯下降。這表明，傳統的細胞凍存保護劑可能不適用于miRNA-155低表達DC-CIK細胞的凍存，雖然能維持其復蘇率，但是不能維持其對白血病細胞的殺傷力。傳統的細胞凍存保護劑多為基于DMSO的標準凍存液，由培養基、胎牛血清和DMSO組成。申請人在CIK細胞常用凍存保護劑基礎上[RPMI1640、胎牛血清和二甲基亞砜按照體積比5:4:1混合，可參見文獻：凍存對細胞因子誘導的殺傷細胞免疫表型及細胞內因子表達的影響，鄭州大學學報(醫學版)2014年1月]進行了優化研究，試圖在保證DC-CIK細胞凍存復蘇率的基礎上最大限度維持DC-CIK細胞的高殺傷力。
技術實現思路
本專利技術旨在克服
技術介紹
中存在的不足，提供一種維持DC-CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑，在保證DC-CIK細胞凍存復蘇率的基礎上最大限度維持DC-CIK細胞的高殺傷力。本專利技術通過如下技術方案得以實現：一種維持DC-CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑，由RPMI1640、胎牛血清和二甲基亞砜、太子參環肽B或C組成。優選地，RPMI1640、胎牛血清和二甲基亞砜按照體積比6:3:1混合。優選地，所述太子參環肽B的濃度為7-9μg/ml。優選地，所述太子參環肽C的濃度為4-6μg/ml。使用上述凍存保護劑凍存DC-CIK細胞的方法：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，轉至-80℃低溫冰箱放置。本專利技術優點：本專利技術凍存保護劑能在保證DC-CIK細胞凍存復蘇率的基礎上最大限度維持DC-CIK細胞的高殺傷力，延續miRNA-155低表達所帶來的強殺傷力。附圖說明圖1為不同組效應細胞復蘇后存活率；圖2為不同組效應細胞對白血病K562/A02細胞系的殺傷活性；圖3為不同組效應細胞對白血病THP-1細胞系的殺傷活性；圖4為不同組效應細胞對白血病HL-60細胞系的殺傷活性。具體實施方式為了更好地解釋本專利技術的技術方案，下面結合具體實施例進一步介紹。實施例中未特別強調的實驗材料均為常規實驗材料，屬于本領域技術人員易于獲得的范疇。實施例1：凍存對miRNA-155低表達DC-CIK細胞殺傷力的影響一、實驗材料1、miRNA-155inhibitor由上海吉瑪制藥技術有限公司提供(如下序列1)；inhibitornegativecontrol由上海吉瑪制藥技術有限公司提供(如下序列2)。序列1：5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’；序列2：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。2、腫瘤細胞為白血病細胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60細胞。二、實驗方法1、效應細胞DC與CIK的分離培養(1)單個核細胞的分離：采集健康志愿者外周血20mL，預冷的PBS1:1稀釋，緩慢加入淋巴細胞分離液上層，650g，4℃離心20min，收集白色細胞層，分離單個核細胞，1640培養基重懸細胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。(2)DC細胞的培養：單個核細胞培養2h后收集貼壁細胞，在完全培養基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)誘導DC生成，于37℃，5％CO2孵育箱中培養，每2天半量換液一次，換液后補充GM-CSF、IL-4，于第6d在培養基中添加TNF-α誘導DC成熟(100ng/mL)，連續培養7d，收集細胞備用。(3)CIK細胞的培養：收集單核細胞中的懸浮細胞，調整細胞密度至1×106/ml，在完全培養基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3單抗(50μg/mL)。每2-3d進行換液，并補充等量的細胞因子，連續培養7天，收集細胞備用。2、效應細胞DC的轉染轉染試劑為美國Invitrogen公司生產的lipofectamine2000，嚴格按照使用說明操作。(1)傳細胞培養板：以6孔板為例，轉染前一天，按1×106/ml密度接種DC細胞于6孔板，每孔加2ml培養基，使轉染時貼壁細胞密度達60％。(2)用DEPC水稀釋miRNA-155inhibitor或inhibitornegativecontrol(NC)，配制終濃度為20μM的存儲液，分裝使用。(3)配制混合液：miRNA-155inhibitor或NC混合液：取10μl上述存儲液，用opti-MEM稀釋，輕輕混勻，配制250μl稀釋液A；lipofectamine2000稀釋液：取5μllipofectamine2000，用opti-MEM稀釋，輕輕混勻，配制250μl稀釋液B。(4)稀釋液A和稀釋液B室溫孵育5分鐘后，將二者輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，配制總體積為500μl的稀釋液C。(5)將6孔板內原培養基吸去，PBS沖洗1次后吸去，每孔加入1.5mlopti-MEM。將稀釋液C加入每孔，使得每孔液體總體積為2ml，miRNA-155inhibitor或NC濃度為100nM。(6)將6孔板放入細胞培養箱培養6小時，吸去含有miRNA-155inhibitor或NC的培養基，PBS沖洗1次后，加入完全培養基2ml，放入細胞培養箱中繼續培養48小時。3、效應細胞DC轉染后miRNA-155的表達量(qRT-PCR)3.1細胞總RNA的提取(1)吸去6孔板中的培養基，用PBS沖洗細胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAisoPlus1ml，緩慢吹打細胞，使細胞充分裂解；(2)將裂解液吸出轉入1.5mlEP管中，冰上靜置5min；(3)在EP管中加入氯仿200μl，劇烈震蕩混勻約15秒，冰上靜置3min；然后于4℃條件下12000g/min離心15分鐘；(4)離心后吸取EP管中上層水相液體500μl轉入新的1.5mlEP管中，加入異丙醇500μl，顛倒混勻，冰上靜置10min；然后于4℃條件下12000g/min離心10分鐘；(5)將EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震蕩本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種維持DC?CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑，其特征在于：由RPMI?1640、胎牛血清和二甲基亞砜、太子參環肽B或C組成。

【技術特征摘要】
1.一種維持DC-CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑，其特征在于：由RPMI1640、胎牛血清和二甲基亞砜、太子參環肽B或C組成。2.根據權利要求1所述的維持DC-CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑，其特征在于：RPMI1640、胎牛血清和二甲基亞砜按照體積比6:3:1混合。3.根據權利要求1所述的維持DC-CIK細胞高殺傷力的凍存保護劑，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：南京佰泰克生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32