一種利用固定化氫過氧化物裂解酶連續化制備天然香料的方法及其裝置制造方法及圖紙

本發明專利技術公開了一種利用固定化氫過氧化物裂解酶連續化制備天然香料的方法及其裝置，其特征在于，該制備方法包括如下步驟：(1)脂肪酸氫過氧化物的制備；(2)莧菜氫過氧化物裂解酶的提取；(3)固定化氫過氧化物裂解酶的制備；(4)己醛的連續化制備。該連續化生產裝置由柱式原料容器(1)、導管(2)、蠕動泵(3)、循環水浴夾套裝置(4)、反應器(5)和產品收集容器(6)組成。本發明專利技術所采用的固定化氫過氧化物裂解酶具有較高操作穩定性，并由此提高了連續化生產過程中的單位體積產量及底物轉化率。本發明專利技術所設計的柱式反應器可實現己醛的連續化制備，制備過程操作簡單，易于控制且成本較低。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種利用固定化氫過氧化物裂解酶將不飽和脂肪酸轉化為天然香料的方法，屬于生物香料制備

技術介紹
本專利技術涉及制備多元不飽和脂肪酸降解產物的過程。這些降解產物是揮發性的天然風味物質，這些物質主要包括反式-2-己烯醛、順-3-己烯醛、己醛等，是新鮮果蔬獨特綠色清新氣味的重要貢獻者，因此又被稱為“綠色信號”。目前為止，C6醛已經被廣泛應用于日化工業、食品行業以及香水制品等產業中。巨大的市場需求促使研究人員展開了大量針對C6醛生產的研究。一般而言，通過化學合成的手段獲得大量穩定的C6醛是最簡單也是最為直接的方法。然而在食品領域，天然手段得到的添加劑或香精香料產品更容易受到消費者的青睞。就同一種產品而言，天然產品的市場銷售價格遠高于化學合成品。天然清香型香精香料的傳統制備方法是直接從植物原料中提取獲得，例如薄荷精油的蒸餾。但是這一方法目前也面臨著諸多問題而難以滿足工業化生產的需求，從而使得模擬植物體內的代謝途徑，酶法催化游離不飽和脂肪酸的氧化反應及其隨后的降解反應以制備己醛、己烯醛等C6醛類的方法具有很強的吸引力。近年來，人們開始嘗試通過酶法來合成醛類物質，如中國專利AN1563310A公開了一種酶催化生產烯醛類香料的方法，該法以C18-C20多遠不飽和脂肪酸為原料，以從天然植物組織中提取的脂肪氧合酶與氫過氧化物裂解酶組成的酶系為催化劑，在室溫15-25℃條件下，使多元不飽和脂肪酸轉移地酶催化裂解成烯醛類香料。中國專利CN101225406A涉及一種利用番石榴組織中存在的酶合成天然香料的方法，該方法提供一種以亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等具有順順-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸為底物，利用番石榴組織中存在的脂肪氧合酶和氫過氧化物裂解酶降解底物，合成具有天然風味香料的方法。目前為止，氫過氧化物裂解酶的不穩定性及其反應的復雜性一直是導致產物產量過低(<20mg/L)并制約此生物合成途徑實現工業化的關鍵因素。
技術實現思路
本專利技術目的之一是提供一種連續化制備亞油酸脂質代謝產物的方法，尤其是通過固定化氫過氧化物裂解酶的催化作用將亞油酸氫過氧化物降解產生天然香料物質。專利技術包括以下幾個步驟：1、脂肪酸氫過氧化物的制備：通過LOX反應制備脂肪酸氫過氧化物(HPOs)。0.1M游離亞油酸分散于pH9.0的硼酸鹽緩沖液中(0.2M)，于發酵罐中4℃下攪拌均勻后加入LOX、通氧并加壓至0.3MPa進行反應。1.5h之后結束反應并取一定量產物經乙醇稀釋后在234nm測定其紫外吸光度，然后根據摩爾吸光系數計算反應液中HPOs的濃度(ε＝25000cm-1M-1)。最后將反應產物溶液置于4℃條件下冷藏待用。2、莧菜氫過氧化物裂解酶的提取：去掉根和莖之后，將新鮮莧菜葉切碎并與pH8.5的Tris-HCl緩沖液(0.1M并含有0.5％(m/v)PVPK-30)按照1:3的比例混合，均漿1min(10s×6)。四層紗布過濾之后所得濾液在4℃下18000×g離心30min。離心沉淀加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.02M，pH6.8)，PBS中含10mMDTT以及0.5％(v/v)TritonX-100。4℃下攪拌1h之后于同樣溫度下18000×g離心30min，所得上清液經30％硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述含有DTT以及TritonX-100的PBS中，即得游離HPL粗酶液。3、殼聚糖復合水凝膠的制備方法如下：a.將殼聚糖和γ-卡拉膠加入到的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。b.使用注射器將步驟a所得混合溶液逐滴滴入NaOH溶液中并攪拌形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。c.在步驟b所得水凝膠微球中加入過量戊二醛，得到醛基活化水凝膠微球。d.在步驟c所得醛基活化水凝膠微球中加入1，6-己二胺。e.過濾得到表面連接著1，6-己二胺的殼聚糖復合水凝膠微球。步驟a所述混合溶液中含有殼聚糖2.5wt％～7.5wt％；γ-卡拉膠2.5wt％～7.5wt％；乙酸溶液5％～25％v/v。步驟b所述NaOH溶液的濃度為0.5M～2.5M，混合溶液與NaOH溶液的體積比1:5～10；所述攪拌過程：攪拌轉速為10～50rpm，攪拌時間為1～5天。步驟d所述1，6-己二胺的添加量為1，6-己二胺：殼聚糖中-NH2摩爾比＝0.5～1.0:1。4、殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶：(一)將殼聚糖復合水凝膠微球浸入EDC水溶液中，然后加入含有HPL的PBS溶液，之后于4～10℃下震蕩10～30min，過濾，得到殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶。(二)用PBS及去離子水清洗殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶。清洗的目的是將其他的雜質洗去，因此清洗次數可以根據需要調整，通常清洗兩次即可。(三)清洗過后的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。步驟(1)所述復合液中殼聚糖復合水凝膠微球與EDC的摩爾比為1:1～10；HPL與殼聚糖復合水凝膠微球的摩爾比為1:1。5、己醛的連續化制備：用于己醛連續化制備的填充床柱式反應器如圖1所示。4～20U的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶被填充于長200～500mm，直徑10.5～20mm的玻璃柱中。反應器的溫度通過外部的循環水浴夾套控制為30～40℃。將濃度為10～50mM的13-HPOD溶液(0.02～0.2MPBS，pH4.0～6.5含有1～3mMDTT)通過蠕動泵連續地加入到反應柱中。當體系達到穩定的時候開始收集流出液并測定其中C6醛的產量。產物定量分析：使用頂空氣相色譜法(HS-GC)測定生成的醛類物質。具體的檢測步驟如下：與分光光度檢測法相同的反應溶液經2min的保溫之后迅速將酶滅活。反應產物使用氣相色譜儀進行測定，即待測樣品迅速轉移至氣相頂空進樣器，70℃下保溫平衡30min并自動進樣。空白為只含游離粗酶液或固定化酶的PBS。反應生成的己醛濃度通過以下公式進行計算：Cs＝As/A0×C0其中，As為反應樣品峰面積；A0為標準樣品峰面積；Cs為反應樣品濃度；C0為標準樣品濃度。本專利技術目的之二是提供了一種填充床柱式反應器，將殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶用于芳香性風味成分C6醛的連續化制備，該裝置由柱式原料容器(1)、導管(2)、蠕動泵(3)、循環水浴夾套裝置(4)、反應器(5)和產品收集容器(6)組成。原料容器(1)頂部通過導管(2)與蠕動泵(3)尾部相連，蠕動泵(3)頂部通過導管(2)與反應器(5)的底部相連，反應器(5)的外部夾有循環水浴夾套裝置(4)，反應器(5)的頂部通過導管(2)與產品收集容器(6)的頂部相連。反應器(5)為低壓玻璃柱，其長為200～500mm，直徑為10.5～20mm。本專利技術與現有技術相比具有以下優點：1)本專利技術所采用的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶顯著提高了產物的單位體積產量。2)與游離酶攪拌式批次反應方式相比，本專利技術所采用的己醛連續化制備方法在提高反應單位體積產量最高可使己醛單位體積產量達到3560±102.1并降低了反應過程中的需酶量。3)本專利技術所設計的柱式反應器可實現己醛的連本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用固定化氫過氧化物裂解酶連續化制備天然香料的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)脂肪酸氫過氧化物的制備；(2)莧菜氫過氧化物裂解酶的提取；(3)固定化氫過氧化物裂解酶的制備；(4)己醛的連續化制備。

【技術特征摘要】
1.一種利用固定化氫過氧化物裂解酶連續化制備天然香料的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)脂肪酸氫過氧化物的制備；(2)莧菜氫過氧化物裂解酶的提取；(3)固定化氫過氧化物裂解酶的制備；(4)己醛的連續化制備。2.根據權利要求1所述一種利用固定化氫過氧化物裂解酶連續化制備天然香料的方法，其特征在于，步驟(3)所述固定化氫過氧化物裂解酶的制備方法為：(一)將水凝膠微球浸入EDC水溶液中，水凝膠微球與EDC的摩爾比為1:1～10，然后加入含有HPL的PBS溶液，HPL與水凝膠微球的摩爾比為1:1，之后于4～10℃下震蕩10～30min，過濾，得到水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；(二)用PBS及去離子水清洗水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；(三)清洗過后的水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。3.根據權利要求2所述一種利用固定化氫過氧化物裂解酶連續化制備天然香料的方法，其特征在于，步驟(一)所述水凝膠微球的制備方法為：a.將2.5wt.％～7.5wt.％的殼聚糖和2.5wt.％～7.5wt.％的γ-卡拉膠加入到含有5％～25％v/v乙酸的溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液；b.使用注射器將步驟a所得混合溶液逐滴滴入濃度為0.5M～2.5M的NaOH溶液中，混合液和NaOH溶液的體積比1:5～10，然后攪拌形成直徑為1–2mm的水凝膠微球；c.在步驟b所得水凝膠微球中加入過量戊二醛，得到醛基活化水凝膠微球；d.在步驟c所得醛基活化水凝膠微球中加入1，6-己二胺，1，6-己二胺的添加量為1，6-己二胺：殼聚糖中-NH2摩爾比＝0.5～1.0:1；e.過濾得到表面連接著...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉慶慶，于勇，朱松明，李文科，
申請(專利權)人：浙江大學自貢創新中心，
類型：發明
國別省市：四川;51