一種活體無損傷觀察二色補血草鹽腺的新方法技術

本發明專利技術涉及一種活體無損傷觀察二色補血草鹽腺的新方法，包括如下步驟：首先，采用乙烯基聚硅氧烷樹脂對二色補血草的葉片下表皮進行負向印記；其次，將聚合的環氧樹脂涂抹在二色補血草葉片的負向印跡上，得葉片的正向印跡；最后，利用普通的光學顯微鏡和普通CCD照相設備，觀察并記錄葉片的正向印跡，得二色補血草葉片的生長形態圖譜。與傳統的指甲油、火棉膠相比，真正實現了無損傷活體觀察，取完印跡后的葉片可以繼續培養，實現對葉片發育的完整跟蹤。本發明專利技術在其他植物葉片表皮的觀察中同樣有良好的觀察效果(如模式植物擬南芥等)。各觀察結果間可比性強，可準確反映出細胞的形狀和行為對葉的形狀的影響。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于細胞學領域，特別涉及一種活體無損傷觀察二色補血草鹽腺的新方法。
技術介紹
在植物發育過程中,細胞的大小和形狀對植物形態建成具有重要的貢獻(Kim?and?Sinha,2003；Guimil?and?Dunand,2006)。Tsukaya(2003)提出的細胞決定理論,則認為細胞是生物體的基本單位,也是器官發生和形態建成的單位,細胞的形狀和行為決定了葉的形狀。這種理論強調,葉的最終形狀是細胞學水平各種狀態的疊加,并在原有細胞理論的基礎上增加了新內容,認為細胞的狀態和行為之間存在著相互影響,特別是葉細胞數量和體積相互補償。因此,研究植物發育過程中細胞數目和大小的變化對闡明植物發育過程中的細胞學基礎理論具有十分重要的意義。在細胞學、育種學以及植物生理學的研究過程中,經常需要測定葉下表皮氣孔的分布、形狀和大小等數據。許多研究者會直接撕取植物材料的表皮制成臨時裝片,在顯微鏡下觀察,或采用印跡法,即在植物葉的表面涂抹火棉膠(或牛皮膠液)和醋酸纖維素膠液等,還有人利用指甲油(Ferris?and?Tayler,1994；林月惠,1996；Berger?and?Altmann,2000)和乒乓球制液(張秀芳等,2002),膠體風干后凝成薄膜,此膜就印有表皮組織各細胞的界跡邊痕及氣孔結構。該種方法的優點是膠膜干燥速度快,缺點是薄膜太薄,在取下的過程中薄膜易拉伸變形。更重要是，上述方法都只能用于觀察離體葉片，缺乏對同一葉片不同生長階段形態信息的記錄，導致各觀察結果間可比性差，無法準確反映出細胞的形狀和行為對葉的形狀的影響。這些傳統方法均是離體取材，對葉片產生了不可逆轉的損害，無法實現葉片發育的連續觀察，所以實現對葉片表皮結構的活體連續觀察意義重大。另外，現有的技術主要針對氣孔等表皮結構展開，而本專利技術采用的二色補血草具有一種特有的表皮結構——鹽腺，如何活體跟蹤鹽腺的發育成為了技術上的瓶頸問題。
技術實現思路
：針對上述問題，本專利技術采用活體葉片兩次印跡，并可以針對同一葉片同一鹽腺的生長變化進行觀察，避免了傳統的離體方法對葉片的損害。而且在對鹽腺觀察的基礎上，可以應用到氣孔和其他植物的表皮結構的觀察。與傳統的指甲油、火棉膠相比，真正實現了無損傷活體觀察，取完印跡后的葉片可以繼續培養，實現對葉片發育的完整跟蹤。為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：一種活體無損傷觀察二色補血草鹽腺的新方法，包括如下步驟：1)將乙烯基聚硅氧烷樹脂，涂抹在待測二色補血草的葉片下表皮，靜置5-10min，挑起樹脂，得二色補血草葉片的負向印記；2)將取完印跡的待測二色補血草放回培養室繼續培養1～2小時后，即可再次進行印跡，為待印跡二色補血草；3)將聚合的環氧樹脂涂抹在二色補血草葉片的負向印跡上，待凝固后，揭下涂層，得葉片的正向印跡，即完整的葉片復制體；4)利用普通的光學顯微鏡和普通CCD照相設備，觀察并記錄葉片的正向印跡，即得二色補血草葉片下表皮形態圖Ⅰ；5)取步驟2)中待印跡的二色補血草，在葉片的相同位置，重復步驟1)-4)，即得二色補血草葉片下表皮形態圖Ⅱ；6)多次重復上述步驟1-5，即得二色補血草葉片表皮各結構的生長形態圖譜。進一步地，所述二色補血草葉片的下表皮包括表皮細胞、鹽腺細胞、氣孔。優選的是，所述的二色補血草為萌發6～30天的二色補血草幼苗。更優選的是，所述的二色補血草為萌發8～12天的二色補血草幼苗。上述的方法在觀察模式植物擬南芥葉片表皮方面有很好的應用(如圖3所示)。上述的方法在觀察植物幼苗葉片表皮結構方面的應用。本專利技術還提供了一種活體無損傷觀察擬南芥葉片的新方法，包括如下步驟：1)將乙烯基聚硅氧烷樹脂，涂抹在待測擬南芥的葉片下表皮，靜置5-10min，挑起樹脂，得擬南芥葉片的負向印記；2)將取完印跡的待測擬南芥放回培養室繼續培養1～2小時后，即可再次進行印跡，為待印跡擬南芥；3)將聚合的環氧樹脂涂抹在擬南芥葉片的負向印跡上，待凝固后，揭下涂層，得葉片的正向印跡，即完整的葉片復制體；4)利用普通的光學顯微鏡和普通CCD照相設備，觀察并記錄葉片的正向印跡，即得擬南芥葉片下表皮形態圖Ⅰ；5)取步驟2)中待印跡的擬南芥，在葉片的相同位置，重復步驟1)-4)，即得擬南芥葉片下表皮形態圖Ⅱ。6)多次重復上述步驟1-5，即得擬南芥葉片的生長形態圖。進一步地，所述擬南芥葉片的下表皮包括表皮細胞、氣孔。優選的是，所述的擬南芥為萌發6～30天的擬南芥幼苗。更優選的是，所述的擬南芥為萌發8～12天的擬南芥幼苗。本專利技術還提供了一種活體無損傷觀察植物幼苗葉片下表皮結構的新方法，包括如下步驟：1)將乙烯基聚硅氧烷樹脂，涂抹在待測植物幼苗的葉片下表皮，靜置，待樹脂變硬后，挑起樹脂，得二色補血草葉片的負向印記；2)將取完印跡的待測植物幼苗放回培養室繼續培養1～2小時后，即可再次進行印跡，為待印跡植物幼苗；3)將聚合的環氧樹脂涂抹在植物幼苗葉片的負向印跡上，待凝固后，揭下涂層，得葉片的正向印跡，即完整的葉片復制體；4)利用普通的光學顯微鏡和普通CCD照相設備，觀察并記錄葉片的正向印跡，即得植物幼苗葉片下表皮形態圖Ⅰ；5)取步驟2)中待印跡的二色補血草，在葉片的相同位置，重復步驟1)-4)，即得植物幼苗葉片下表皮形態圖Ⅱ。6)多次重復上述步驟1-5，即得植物幼苗葉片表皮各結構的生長形態圖譜。本專利技術有益的效果是：1.本專利技術與傳統的指甲油、火棉膠相比，真正實現了無損傷活體觀察，取完印跡后的葉片可以繼續培養，實現對葉片發育的完整跟蹤。第一次負向印跡采用的樹脂是“乙烯基聚硅氧烷樹脂”，在醫學中一般用于牙科的印模，具有可滲透性好、精細程度高和無損害性的優點，本專利技術首次將其用于植物葉片，能夠保證對葉片進行的是活體觀察，即不需要將葉片取下，直接在生長的葉片上進行操作，取下樹脂印跡后葉片還可以繼續生長，而葉片表皮此時的發育狀態就完全印跡在樹脂上，所以該“乙烯基聚硅氧烷樹脂”與普通的指甲油、火棉膠相比，最大的優勢是獲得葉片印跡后，葉片可以繼續放回培養，可以針對同一個葉片進行連續的跟蹤觀察，對于觀察葉片的分化有重要作用。而普通的指甲油、火棉膠處理后的葉片已經死亡，無法對葉片進行連續的跟蹤觀察。2.本專利技術通過兩次印跡獲得了葉片復制體，與常規的一次印跡后的膠膜相比，其突出的特點和優勢是，采用的兩種樹脂連續印跡方法，獲得的是葉片的正向印跡，觀察植物葉片的結構和發育時更加直觀。傳統對葉片的印跡觀察采用的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種活體無損傷觀察二色補血草鹽腺的新方法，其特征在于，包括如下步驟：1)將乙烯基聚硅氧烷樹脂，涂抹在待測二色補血草的葉片下表皮，靜置5?10min，挑起樹脂，得二色補血草葉片的負向印記；2)將取完印跡的待測二色補血草放回培養室繼續培養1～2小時后，即可再次進行印跡，為待印跡二色補血草；3)將聚合的環氧樹脂涂抹在二色補血草葉片的負向印跡上，待凝固后，揭下涂層，得葉片的正向印跡，即完整的葉片復制體；4)利用普通的光學顯微鏡和普通CCD照相設備，觀察并記錄葉片的正向印跡，即得二色補血草葉片下表皮形態圖Ⅰ；5)取步驟2)中待印跡的二色補血草，在葉片的相同位置，重復步驟1)?4)，即得二色補血草葉片下表皮形態圖Ⅱ；6)多次重復上述步驟1)?5)，即得二色補血草葉片表皮各結構的生長形態圖譜。

【技術特征摘要】
1.一種活體無損傷觀察二色補血草鹽腺的新方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)將乙烯基聚硅氧烷樹脂，涂抹在待測二色補血草的葉片下表皮，靜置5-10min，挑
起樹脂，得二色補血草葉片的負向印記；
2)將取完印跡的待測二色補血草放回培養室繼續培養1～2小時后，即可再次進行印跡，
為待印跡二色補血草；
3)將聚合的環氧樹脂涂抹在二色補血草葉片的負向印跡上，待凝固后，揭下涂層，得
葉片的正向印跡，即完整的葉片復制體；
4)利用普通的光學顯微鏡和普通CCD照相設備，觀察并記錄葉片的正向印跡，即得
二色補血草葉片下表皮形態圖Ⅰ；
5)取步驟2)中待印跡的二色補血草，在葉片的相同...

【專利技術屬性】
技術研發人員：袁芳，王寶山，
申請(專利權)人：山東師范大學，
類型：發明
國別省市：山東;37