一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法及其應(yīng)用，包括啤酒酵母菌的分離純化和鑒定、凝結(jié)芽孢桿菌的分離純化和鑒定、沼澤紅假單胞菌的分離純化和鑒定、復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵液的制備，本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)將啤酒酵母菌、凝結(jié)芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌按特定比例混合而制成，將其用于卡拉白魚成魚養(yǎng)殖，既能分解養(yǎng)殖水體中的殘餌和動(dòng)物排泄物，降低水體的氨氮、亞硝態(tài)氮和CODMn的含量，增加溶氧量，達(dá)到凈化水質(zhì)的效果；又能改善養(yǎng)殖卡拉白魚腸道微生物菌群，進(jìn)而增強(qiáng)魚體內(nèi)消化酶的活性，提高飼料利用率，促進(jìn)生長(zhǎng)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種用于卡拉白魚養(yǎng)殖的復(fù)合微生態(tài)制劑的制備，具體是由啤酒酵母、凝結(jié)芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌制成復(fù)合微生態(tài)制劑，以及將其應(yīng)用于卡拉白魚的養(yǎng)殖。
技術(shù)介紹
卡拉白魚(ChalcalburnuschalcoidesAralensis)主要分布于黑海、咸海和里海水域以及與之相連的水系，隸屬于鯉科、雅羅魚亞科、卡拉白魚屬，在國(guó)外為瀕危野生種，2001年引入我國(guó)。卡拉白魚具有耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)、食性廣、味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)，是一種有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的小型經(jīng)濟(jì)魚類，有很好的市場(chǎng)前景。近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展越來(lái)越迅速，集約化高密度養(yǎng)殖的發(fā)展導(dǎo)致水體的生態(tài)環(huán)境遭到破壞，水產(chǎn)動(dòng)物病害以及水產(chǎn)動(dòng)物間的病原體交叉感染愈演愈烈。而目前控制病害的主要手段依然是使用抗生素類藥物，長(zhǎng)期大量使用抗生素類藥物不僅會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物免疫力下降，增加病原菌耐藥性，破壞養(yǎng)殖水體的正常的微生態(tài)環(huán)境，以及引發(fā)二次感染或繼發(fā)性感染，還會(huì)造成抗生素在魚體中殘留、富集，進(jìn)而對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。正是因?yàn)榭股仡愃幬锏倪@些危害，目前世界各國(guó)陸續(xù)禁用或者限制了抗生素類藥物的使用。未來(lái)有望徹底禁止抗生素類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，由此催生出了無(wú)殘留、無(wú)毒副作用、綠色安全的微生態(tài)制劑飼料添加劑。微生態(tài)制劑是一種通過(guò)改善動(dòng)物周圍的或與其相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)，以此增加飼料的利用率，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)疾病的應(yīng)答能力以及改善其周圍環(huán)境的活菌制劑。作為抗生素的替代品，微生態(tài)制劑的安全范圍比較大，在養(yǎng)殖動(dòng)物中長(zhǎng)期使用不會(huì)產(chǎn)生毒副作用和抗藥性。目前市場(chǎng)上有多種多樣的微生態(tài)制劑，但它們作為飼料添加劑還達(dá)不到人們的預(yù)期效果，這是由于不同種類的養(yǎng)殖動(dòng)物所需要益生菌的種類、數(shù)量和配比各不相同，導(dǎo)致它們?cè)陴B(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)不能很好地協(xié)同作用，從而影響了其作為飼料添加劑應(yīng)有的效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)主要是提供一種由特定配比的三種微生物活菌體所組成的復(fù)合微生態(tài)制劑及其制備方法，并將該微生態(tài)制劑應(yīng)用于一齡卡拉白魚的養(yǎng)殖中，可促進(jìn)卡拉白魚的生長(zhǎng)，凈化養(yǎng)殖水體的水質(zhì)。本專利技術(shù)以養(yǎng)殖池塘底泥為樣品，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理后，運(yùn)用平板涂布法，將稀釋后的樣品涂布相應(yīng)的分離培養(yǎng)基平板，然后把涂布后的分離培養(yǎng)基放置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一段時(shí)間后根據(jù)各個(gè)目的菌株的形態(tài)特征挑取相應(yīng)的菌株，在培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化。待得到純菌株后根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化特征鑒定，以及根據(jù)16SrDNA基因或ITS區(qū)基因進(jìn)行分子鑒定以確定目標(biāo)菌株。本專利技術(shù)所分離純化的啤酒酵母菌、凝結(jié)芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌已證明無(wú)毒性，所分離菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵之后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，啤酒酵母菌的活菌數(shù)大于3.5×109cfu/mL，凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)大于8.3×109cfu/mL，沼澤紅假單胞菌活菌數(shù)大于1.7×109cfu/mL，將其按特定比例混合后即可用于卡拉白魚養(yǎng)殖中。本專利技術(shù)的技術(shù)解決方案一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于包括以下制備步驟：一、啤酒酵母菌的分離純化和鑒定1.啤酒酵母菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取10g采取的樣品放入裝有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩混勻，用無(wú)菌水將樣品溶液進(jìn)行梯度稀釋，即在無(wú)菌條件下用吸管吸取1mL樣品溶液，加入到裝有9mL無(wú)菌水的離心管中，充分混勻，將樣品稀釋為10-1，然后吸取1mL稀釋的樣品加入到另一裝有9mL無(wú)菌水的離心管中，稀釋成10-2，按此種方法依次稀釋至10-6；c．取稀釋濃度為10-4、10-5和10-6的樣品溶液涂布PDA培養(yǎng)基平板，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天。待菌落長(zhǎng)出后，挑選個(gè)體較大，表面光滑濕潤(rùn)，呈凸起狀，中間略有凹陷的單菌落，在PDA培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管；2.菌株的生理生化鑒定根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌株的生理生化性質(zhì)測(cè)定，將鑒定結(jié)果與《真菌鑒定手冊(cè)》上所述啤酒酵母菌的生理生化特征相對(duì)照；3.ITS區(qū)基因序列鑒定用機(jī)械破碎法提取菌株基因組DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4為引物，基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到500~600bp的特異性條帶，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去生工進(jìn)行DNA測(cè)序，將所得到的序列導(dǎo)入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxonserver進(jìn)行序列比對(duì)。二、凝結(jié)芽孢桿菌的分離純化和鑒定1.凝結(jié)芽孢桿菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取采集的樣品10g，放入已滅菌的裝有90ml蒸餾水和小玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩混勻后將三角瓶放置于80℃水浴鍋中，加熱20分鐘后靜置冷卻至室溫，用無(wú)菌水將冷卻后的樣品溶液進(jìn)行梯度稀釋至10-7；c．取稀釋濃度為10-5、10-6、10-7的樣品溶液涂布MRS固體培養(yǎng)基平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌體淡黃色，不透明，呈圓形、凸起、扁平狀的單菌落利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行純化，將純培養(yǎng)物以點(diǎn)接法接種于含溴甲酚紫指示劑的YPD培養(yǎng)基，篩選其中的具有產(chǎn)酸能力的芽孢桿菌，37℃培養(yǎng)兩天后選取其中一株產(chǎn)生透明圈較大的菌株，保存于甘油管和牛奶管中；2.菌株的生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)挑選的菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，將生理生化鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版上關(guān)于芽孢桿菌屬的描述相對(duì)照；3.16SrDNA序列鑒定使用酶解法和SDS-高鹽法相結(jié)合提取菌株的基因組DNA序列，以細(xì)菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴(kuò)增16SrDNA片段，得到1400~1500bp的特異性片段，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去生工進(jìn)行DNA測(cè)序，將所得到的序列導(dǎo)入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxonserver進(jìn)行序列比對(duì)。三、沼澤紅假單胞菌的分離純化和鑒定1.沼澤紅假單胞菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取采集的底泥樣品20g，放入滅菌的500ml錐形瓶中，添加富集培養(yǎng)基至離瓶口2~3cm，然后將錐形瓶用橡膠塞和塑料膜密封營(yíng)造厭氧環(huán)境，再將其放置于裝有60W白熾燈的不透明紙箱中，調(diào)節(jié)距離，使培養(yǎng)基接受的光照強(qiáng)度為2000~4000lx，溫度為30℃，在此條件下培養(yǎng)一周，取富集液按20%濃度再連續(xù)轉(zhuǎn)接富集兩次；c．取步驟b富集三次后的富集液進(jìn)行梯度稀釋至10-8；d．取10-6、10-7和10-8稀釋液涂布光合細(xì)菌分離培養(yǎng)基平板，以無(wú)菌瓊脂溶液覆蓋到涂布后的分離培養(yǎng)基上，制造厭氧環(huán)境，然后將覆蓋瓊脂后的平板放置于光照強(qiáng)度為2000~4000lx，溫度為30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，待菌落長(zhǎng)出后，挑選淺紅色、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、中間有隆起的菌落，在分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管。2.菌株的生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)所分離菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，生理生化鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版上關(guān)于光合細(xì)菌的描述相對(duì)照；3.16SrDNA序列鑒定采用酶解法和SDS-高鹽法相結(jié)合提取菌株的基因組DNA序列，以細(xì)菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴(kuò)增16SrDNA片段，得到14本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于包括以下制備步驟：一、啤酒酵母菌的分離純化和鑒定啤酒酵母菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取10g采取的樣品放入裝有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩混勻，用無(wú)菌水將樣品溶液進(jìn)行梯度稀釋，即在無(wú)菌條件下用吸管吸取1mL樣品溶液，加入到裝有9mL無(wú)菌水的離心管中，充分混勻，將樣品稀釋為10?1，然后吸取1mL稀釋的樣品加入到另一裝有9mL無(wú)菌水的離心管中，稀釋成10?2，按此種方法依次稀釋至10?6；c．取稀釋濃度為10?4、10?5和10?6的樣品溶液涂布PDA培養(yǎng)基平板，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天；待菌落長(zhǎng)出后，挑選個(gè)體較大，表面光滑濕潤(rùn)，呈凸起狀，中間略有凹陷的單菌落，在PDA培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管；菌株的生理生化鑒定根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌株的生理生化性質(zhì)測(cè)定，將鑒定結(jié)果與《真菌鑒定手冊(cè)》上所述啤酒酵母菌的生理生化特征相對(duì)照；ITS區(qū)基因序列鑒定用機(jī)械破碎法提取菌株基因組DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4為引物，基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到500~600bp的特異性條帶，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去生工進(jìn)行DNA測(cè)序，將所得到的序列導(dǎo)入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon?server進(jìn)行序列比對(duì)；二、凝結(jié)芽孢桿菌的分離純化和鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取采集的樣品10g，放入已滅菌的裝有90ml蒸餾水和小玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩混勻后將三角瓶放置于80℃水浴鍋中，加熱20分鐘后靜置冷卻至室溫，用無(wú)菌水將冷卻后的樣品溶液進(jìn)行梯度稀釋至10?7；c．取稀釋濃度為10?5、10?6、10?7的樣品溶液涂布MRS固體培養(yǎng)基平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌體淡黃色，不透明，呈圓形、凸起、扁平狀的單菌落利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行純化，將純培養(yǎng)物以點(diǎn)接法接種于含溴甲酚紫指示劑的YPD培養(yǎng)基，篩選其中的具有產(chǎn)酸能力的芽孢桿菌，37℃培養(yǎng)兩天后選取其中一株產(chǎn)生透明圈較大的菌株，保存于甘油管和牛奶管中；菌株的生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)挑選的菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，將生理生化鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版上關(guān)于芽孢桿菌屬的描述相對(duì)照；16S?rDNA序列鑒定使用酶解法和SDS?高鹽法相結(jié)合提取菌株的基因組DNA序列，以細(xì)菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴(kuò)增16SrDNA片段，得到1400~1500bp的特異性片段，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去生工進(jìn)行DNA測(cè)序，將所得到的序列導(dǎo)入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon?server進(jìn)行序列比對(duì)；三、沼澤紅假單胞菌的分離純化和鑒定沼澤紅假單胞菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取采集的底泥樣品20g，放入滅菌的500ml錐形瓶中，添加富集培養(yǎng)基至離瓶口2~3cm，然后將錐形瓶用橡膠塞和塑料膜密封營(yíng)造厭氧環(huán)境，再將其放置于裝有60W白熾燈的不透明紙箱中，調(diào)節(jié)距離，使培養(yǎng)基接受的光照強(qiáng)度為2000~4000lx，溫度為30℃，在此條件下培養(yǎng)一周，取富集液按20%濃度再連續(xù)轉(zhuǎn)接富集兩次；c．取步驟b富集三次后的富集液進(jìn)行梯度稀釋至10?8；d．取10?6、10?7和10?8稀釋液涂布光合細(xì)菌分離培養(yǎng)基平板，以無(wú)菌瓊脂溶液覆蓋到涂布后的分離培養(yǎng)基上，制造厭氧環(huán)境，然后將覆蓋瓊脂后的平板放置于光照強(qiáng)度為2000~4000lx，溫度為30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，待菌落長(zhǎng)出后，挑選淺紅色、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、中間有隆起的菌落，在分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管；菌株的生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)所分離菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，生理生化鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版上關(guān)于光合細(xì)菌的描述相對(duì)照；16SrDNA序列鑒定采用酶解法和SDS?高鹽法相結(jié)合提取菌株的基因組DNA序列，以細(xì)菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴(kuò)增16SrDNA片段，得到1400~1500bp的特異性片段；將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去生工進(jìn)行DNA序列的測(cè)定，將所得到的序列導(dǎo)入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxon?server進(jìn)行序列比對(duì)；四、復(fù)合微生態(tài)制劑發(fā)酵液的制備（1）啤酒酵母菌發(fā)酵液的制備a．菌種活化：將保存的啤酒酵母菌菌種劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3天，在平板上形成啤酒酵母菌單菌落；b．一級(jí)種子液制備：制備100mL?PDA液體培養(yǎng)基，裝入300mL錐形瓶中，滅菌；挑取步驟a活化的啤酒酵母菌單菌落接種于PDA液體培...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種卡拉白魚養(yǎng)殖用復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于包括以下制備步驟：一、啤酒酵母菌的分離純化和鑒定啤酒酵母菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取10g采取的樣品放入裝有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩混勻，用無(wú)菌水將樣品溶液進(jìn)行梯度稀釋，即在無(wú)菌條件下用吸管吸取1mL樣品溶液，加入到裝有9mL無(wú)菌水的離心管中，充分混勻，將樣品稀釋為10-1，然后吸取1mL稀釋的樣品加入到另一裝有9mL無(wú)菌水的離心管中，稀釋成10-2，按此種方法依次稀釋至10-6；c．取稀釋濃度為10-4、10-5和10-6的樣品溶液涂布PDA培養(yǎng)基平板，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天；待菌落長(zhǎng)出后，挑選個(gè)體較大，表面光滑濕潤(rùn)，呈凸起狀，中間略有凹陷的單菌落，在PDA培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管；菌株的生理生化鑒定根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌株的生理生化性質(zhì)測(cè)定，將鑒定結(jié)果與《真菌鑒定手冊(cè)》上所述啤酒酵母菌的生理生化特征相對(duì)照；ITS區(qū)基因序列鑒定用機(jī)械破碎法提取菌株基因組DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4為引物，基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到500~600bp的特異性條帶，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去生工進(jìn)行DNA測(cè)序，將所得到的序列導(dǎo)入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxonserver進(jìn)行序列比對(duì)；二、凝結(jié)芽孢桿菌的分離純化和鑒定凝結(jié)芽孢桿菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取采集的樣品10g，放入已滅菌的裝有90ml蒸餾水和小玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩混勻后將三角瓶放置于80℃水浴鍋中，加熱20分鐘后靜置冷卻至室溫，用無(wú)菌水將冷卻后的樣品溶液進(jìn)行梯度稀釋至10-7；c．取稀釋濃度為10-5、10-6、10-7的樣品溶液涂布MRS固體培養(yǎng)基平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌體淡黃色，不透明，呈圓形、凸起、扁平狀的單菌落利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行純化，將純培養(yǎng)物以點(diǎn)接法接種于含溴甲酚紫指示劑的YPD培養(yǎng)基，篩選其中的具有產(chǎn)酸能力的芽孢桿菌，37℃培養(yǎng)兩天后選取其中一株產(chǎn)生透明圈較大的菌株，保存于甘油管和牛奶管中；菌株的生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)挑選的菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，將生理生化鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版上關(guān)于芽孢桿菌屬的描述相對(duì)照；16SrDNA序列鑒定使用酶解法和SDS-高鹽法相結(jié)合提取菌株的基因組DNA序列，以細(xì)菌和放線菌的通用引物PA、PB為引物，基因組DNA為模板，擴(kuò)增16SrDNA片段，得到1400~1500bp的特異性片段，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送去生工進(jìn)行DNA測(cè)序，將所得到的序列導(dǎo)入NCBI中的BLAST軟件或EzTaxonserver進(jìn)行序列比對(duì)；三、沼澤紅假單胞菌的分離純化和鑒定沼澤紅假單胞菌的分離純化a．采取池塘底泥，放置于無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆茫籦．取采集的底泥樣品20g，放入滅菌的500ml錐形瓶中，添加富集培養(yǎng)基至離瓶口2~3cm，然后將錐形瓶用橡膠塞和塑料膜密封營(yíng)造厭氧環(huán)境，再將其放置于裝有60W白熾燈的不透明紙箱中，調(diào)節(jié)距離，使培養(yǎng)基接受的光照強(qiáng)度為2000~4000lx，溫度為30℃，在此條件下培養(yǎng)一周，取富集液按20%濃度再連續(xù)轉(zhuǎn)接富集兩次；c．取步驟b富集三次后的富集液進(jìn)行梯度稀釋至10-8；d．取10-6、10-7和10-8稀釋液涂布光合細(xì)菌分離培養(yǎng)基平板，以無(wú)菌瓊脂溶液覆蓋到涂布后的分離培養(yǎng)基上，制造厭氧環(huán)境，然后將覆蓋瓊脂后的平板放置于光照強(qiáng)度為2000~4000lx，溫度為30℃的環(huán)境下培養(yǎng)一周，待菌落長(zhǎng)出后，挑選淺紅色、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、中間有隆起的菌落，在分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，直至得到純培養(yǎng)物，保存于甘油管和牛奶管；菌株的生理生化鑒定根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)所分離菌株進(jìn)行生理...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：單金峰，吳春，丁辰龍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：江蘇;32