腸道病毒熒光PCR檢測試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種采用熒光PCR技術(shù)特異性檢測樣品中腸道病毒核酸存在的試劑盒。利用本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在腸道病毒核酸，該試劑盒能夠靈敏地檢測并鑒別樣品中存在的腸道病毒，其檢測下限為10拷貝每反應(yīng)體系，在疾病監(jiān)測、臨床診斷等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種采用熒光PCR技術(shù)特異性檢測樣品中腸道病毒核酸存在的試劑盒，屬于腸道病毒的體外診斷領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
腸道病毒屬于單鏈正股RNA病毒，病毒體呈球型，衣殼為20面體對稱結(jié)構(gòu)，無包膜，具有感染性。在宿主細(xì)胞漿內(nèi)增殖，迅速引起細(xì)胞病變。主要經(jīng)糞一口途徑傳播，臨床表現(xiàn)多樣化，引起人類多種疾病，如脊髓灰質(zhì)炎、手足口病、麻痹、無菌性腦炎、心肌損傷、腹瀉和皮疹等。人腸道病毒至少由72個(gè)血清型組成，其種類有：①人脊髓灰質(zhì)炎病毒1～3型；②人柯薩奇病毒A組1～22型和24型（A-23型為埃可病毒9型），B組1～6型；③埃可病毒1～9，11～27，29～34共32個(gè)血清型；④新型腸道病毒68～72型，其中1971年分出的70型，能引起急性出血性結(jié)膜炎備受重視，72型為甲型肝炎病毒。輪狀病毒、腸道腺病毒。在實(shí)驗(yàn)室檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點(diǎn)逐漸呈現(xiàn)出要替代以細(xì)胞培養(yǎng)和血清學(xué)檢測為主的傳統(tǒng)檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測的特異性和敏感性的基礎(chǔ)。本專利技術(shù)針對腸道病毒特異的靶序列設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，利用real-timeRT-PCR的方法，用來鑒別檢測樣品中腸道病毒核酸，可以快速獲得特異性檢測結(jié)果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)主要解決的技術(shù)問題是快速準(zhǔn)確地檢測樣品中是否存在腸道病毒，提供一種特異性檢測腸道病毒的熒光PCR試劑盒。本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種特異性檢測樣品中腸道病毒的試劑盒，組分包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。其中PCR反應(yīng)液主要含有相關(guān)的引物和探針、反應(yīng)緩沖液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)Taq酶，陰性質(zhì)控品為無RNase和DNase水，陽性質(zhì)控品為含有腸道病毒檢測靶序列的RNA。PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增的引物為P1和P2，P1和P2為針對腸道病毒基因組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性引物；PCR反應(yīng)液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針為Probe1、2、3，為針對腸道病毒基因組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性探針，其中熒光報(bào)告基團(tuán)X1為FAM，熒光淬滅基團(tuán)Y1為Eclipse（見表1）。表1檢測腸道病毒的引物和探針序列名稱序列P15`-CCCTGAATGCGGCTAATC-3`P25`-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3`Probe15`-X1-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-Y1-3`Probe25`-X1-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-Y1-3`Probe35`-X1-TAACTGCGGAGCRCGCACCCTC-Y1-3`本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供本熒光PCR檢測試劑盒在檢測腸道病毒的應(yīng)用方法，包括：試劑盒選用的PCR反應(yīng)體系為20μl，包括2×PCR緩沖液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探針0.2μl、逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)Taq酶混合液0.8μl、樣品RNA2μl，加滅菌水至終體系20μl。試劑盒的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為逆轉(zhuǎn)錄階段：42℃，10min；預(yù)變性階段：94℃，10sec；預(yù)擴(kuò)增階段：變性94℃，5sec；退火50℃，20sec；延伸72℃，20sec；共5個(gè)循環(huán)。注意本階段不采集熒光信號。檢測階段：變性94℃，5sec；退火56℃，50sec；延伸72℃，15sec；共40個(gè)循環(huán)。在退火步驟檢測熒光信號。質(zhì)量控制：每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陰、陽性對照，陰性對照無Ct值（或Ct值為0），陽性對照Ct值≤30，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立。結(jié)果判讀：陽性：出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，Ct值≤35；可疑：出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，但Ct值＞35；陰性：沒有出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈“S”型；對可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)還是出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。樣本要求：臨床樣本類型包括糞便標(biāo)本、皰疹液、咽拭子和病毒培養(yǎng)物；臨床樣本采集后應(yīng)帶冰運(yùn)輸，-20℃保存，不能反復(fù)凍融；從臨床樣本提取RNA，建議采用性能穩(wěn)定可靠的商品化試劑盒，具體方法參見相應(yīng)商品化試劑盒說明書，提取的RNA應(yīng)立即檢測，否則，應(yīng)將RNA分裝后-80℃～-20℃保存。本專利技術(shù)提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出腸道病毒的核酸，但不能檢出非腸道病毒病原體的核酸；對腸道病毒核酸的檢測下限為10拷貝每反應(yīng)體系；只需要2小時(shí)即可完成檢測，可為腸道病毒的疾病監(jiān)測和臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。附圖說明圖1為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測腸道病毒核酸靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。從左至右的5條曲線分別為腸道病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA梯度稀釋后（2×106-2×102copies/μl）擴(kuò)增結(jié)果。橫坐標(biāo)為反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測信號的DRn值。圖2為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系對腸道病毒核酸檢測特異性擴(kuò)增曲線圖。腸道病毒出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，而其他病原微生物質(zhì)控毒株均未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線。橫坐標(biāo)為反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測信號的DRn值。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本專利技術(shù)的優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，這里列出的實(shí)施例僅僅為示例性說明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對本專利技術(shù)范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的目的。引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成利用Blast工具對Genbank和國內(nèi)外文獻(xiàn)中所有的腸道病毒基因組序列進(jìn)行分析，分別選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測靶序列，腸道病毒檢測靶序列為5’UTR；并針對這檢測靶序列設(shè)計(jì)和合成引物和探針（見表1）。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中腸道病毒的檢測探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記Eclipse熒光淬滅基團(tuán)。檢測菌種的準(zhǔn)備本實(shí)施例中所使用的腸道病毒以及其他陰性對照毒株（腺病毒3型、7型，流感病毒AH1N1、AH3N2、AH7N9，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，副流感病毒3型，鼻病毒）均購買于中國藥品生物制品檢定所。菌株RNA的抽提選用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑QIAampDSPVirusSpinKit(國械備20140008QIAGENGmbH)提取毒株RNA。具體步驟參考試劑盒操作說明書。引物和探針的篩選采用設(shè)計(jì)的引物和探針分別檢測提取的腸道病毒和陰性對照毒株的基因組RNA，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，篩選出靈敏度、特異性和重復(fù)性最佳的引物探針組合（見序列表，腸道病毒正向引物P1、反向引物P2和探針Probe1、2、3）。標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備分別利用P1、P2引物，RT-PCR擴(kuò)增腸道病毒特異性基因片段，并克隆至含有T7啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒（如pGEM-Teasyvector），使用大連寶生物公司的RNAPolymerase，合成RNA，加入無RNA酶本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于特異性檢測樣品中腸道病毒的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列如下：P1：5`?CCCTGAATGCGGCTAATC?3`，?P2：5`?ATTGTCACCATAAGCAGCCA?3`，PCR反應(yīng)液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的序列如下：Probe1：5`?X1?CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT?Y1?3`，Probe2：5`?X1?AACTGCGGAGCACACGCCCAC?Y1?3`，Probe3：5`?X1?TAACTGCGGAGCRCGCACCCTC?Y1?3`，Probe熒光報(bào)告基團(tuán)X1為FAM，熒光淬滅基團(tuán)Y1為Eclipse。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于特異性檢測樣品中腸道病毒的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列如下：
P1：5`-CCCTGAATGCGGCTAATC-3`，
P2：5`-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3`，
PCR反應(yīng)液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的序列如下：
Probe1：5`-X1-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-Y1-3`，
Probe2：5`-X1-AACTGCGGAGCACACGC...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：不公告發(fā)明人，
申請(專利權(quán))人：江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32