雜交瘤細胞株YQQD8及其產生的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體制造技術

本發明專利技術涉及雜交瘤細胞株YQQD8及其產生的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體。雜交瘤細胞株YQQD8，該細胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC?NO.C201534，分類命名為雜交瘤細胞株YQQD8。用常規非競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)法測得YQQD8的鼠腹水抗體的效價可達2.56×106。由其分泌產生的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體可以較好地識別辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素，對辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素的50％抑制濃度IC50依次為8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，對辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素的交叉反應率范圍為62.9％-170％；可應用于定量測定辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素總量。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及雜交瘤細胞株YQQD8及其產生的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體。
技術介紹
辣椒素類化合物是使辣椒具有辛辣刺激的主要化學物質，其成分主要包括辣椒素、二氫辣椒素、高二氫辣椒素、降二氫辣椒素、高辣椒素等化合物。其中辣椒素和二氫辣椒素約占辣椒素類物質總量的90％，并提供了約90％的辣熱感刺激。除了賦予食品辛辣味被用作調味品以外，辣椒素類物質還具有消炎鎮痛、抗病菌、抗腫瘤作用，能促進脂肪燃燒、降低血脂，抑制胃酸分泌、對胃黏膜損傷有保護作用等藥用價值。在農藥領域，辣椒素類物質被認為是一種理想的無公害農藥，已有報道被應用于水果、蔬菜、谷物等作物上，免除了耐藥性及殘留檢驗。在輕工業領域可被用于高檔特種防污涂料，防止海洋水生物對船體的附著；用于電纜材料中以驅趕老鼠啃咬等。合成辣椒素具有與天然辣椒素類似的結構部和功能，且在價格和辣度上比天然辣椒素更占優勢，也被廣泛應用于醫藥、殺蟲劑、防污涂料、軍事武器等領域。因此，辣椒素類物質總量分析測定方法的研究對辣椒產品的研發與標準化及其品質評價意義重大。現有的辣椒素類物質分析檢測方法包括感官鑒定法、凱氏定氮法、化學檢測法(包括呋喃甲醛法、三氯化鐵法和氧氯釩法)、分光光度法、光譜測定法、薄層色譜法、高效液相色譜法、色譜-質譜聯用等。其中感官鑒定法是最早評估辣度的方法，雖然簡單直接,但檢測結果易受主觀因素影響，重復性差、敏感度變化大，且香味對辣味的影響、心理上的預料沒有標準。化學檢測法多用于辣椒素類物質的定性分析。薄層色譜法由于操作復雜費時，且測定結果靈敏度和準確度不高，應用較少。高效液相色譜法、色譜-質譜聯用等現代儀器檢測方法是辣椒素類物質最常用的檢測方法，其靈敏度高、準確性好，但是儀器設備昂貴，，對實驗環境要求高，且要求專業操作人員，難以實現快速檢測。近年來迅速發展起來的免疫分析方法由于克服了上述方法的缺點，并具有特異性強、靈敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉、適于現場批量檢測等優點，被廣泛應用于醫學、農學等各個領域。免疫分析是基于抗原、抗體的特異性識別反應的一種分析方法，其核心試劑是高質量的特異性抗體。所以要建立辣椒素類物質總量免疫分析方法，首先要獲得抗辣椒素類物質的通用抗體。由于辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素應用較多，且含量相比其他辣椒素類物質多。因此，制得抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用抗體即可滿足檢測需求。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有特異性強、穩定性好，一旦建立雜交瘤細胞株后，可連續穩定生產抗體。目前，國內外鮮有針對辣椒素類物質抗體的報道，特別是辣椒素類物質單克隆抗體未見報道。因此，研制辣椒素類物質單克隆抗體不僅填補了辣椒素類物質免疫檢測的空白，為辣椒素類物質的快速檢測開辟新思路，對實現辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素總量免疫定量檢測具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供雜交瘤細胞株YQQD8及其產生的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體。為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案為：提供雜交瘤細胞株YQQD8，該細胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCCNO.C201534，分類命名為雜交瘤細胞株YQQD8。其具有序列表中SEQIDNO.1所示的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體重鏈可變區編碼基因序列和序列表中SEQIDNO.2所示的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體輕鏈可變區編碼基因序列。抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體，它由保藏編號為CCTCCNO.C201534的雜交瘤細胞株YQQD8分泌產生。其重鏈可變區具有序列表中SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；輕鏈可變區具有序列表中SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。本專利技術提供的雜交瘤細胞株YQQD8是采用兩步篩選法獲得的，其具體步驟為：以香蘭素胺鹽酸鹽與丁二酸酐為原料，經一步反應合成人工半抗原化合物，將半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯后即得辣椒素類物質通用人工完全抗原。將BALB/c小鼠經辣椒素類物質通用人工完全抗原免疫2-4次后，用2倍于前一次免疫劑量的辣椒素類物質完全抗原Capsaicin-BSA作最后一次加強免疫，3天后進行細胞融合，融合細胞用液體培養基進行培養。采用ELISA方法分兩步進行篩選融合細胞：第一步采用間接ELISA法篩選出抗辣椒素類物質而不抗包被抗原載體蛋白OVA(卵清白蛋白)的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔培養液進行檢測，用辣椒素作為競爭，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用半固體培養基進行亞克隆細胞的培養，克隆后待細胞集落長至肉眼可見大小時，分別將每個細胞集落挑至液體培養基中，采用同樣的兩步篩選法進行檢測，如此重復克隆1次后，最終篩選獲得雜交瘤細胞株YQQD8。本專利技術提供的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體的制備方法，步驟如下：將獲得的雜交瘤細胞株YQQD8注射預先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體。按上述方案，所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體操作為：用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心30min，吸取上清，將所得腹水上清與3倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33μL，室溫混合30min，4℃靜置2h以上；4℃，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的0.1mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調節該混合液的pH值至7.4，4℃預冷，冰浴條件下緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體，將抗體凍干粉置-20℃冰箱中備用；所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化本文檔來自技高網...

【技術保護點】
雜交瘤細胞株YQQD8，該細胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC?NO.C201534，分類命名為雜交瘤細胞株YQQD8。

【技術特征摘要】
1.雜交瘤細胞株YQQD8，該細胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中國典型培養物保
藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCCNO.C201534，分類命
名為雜交瘤細胞株YQQD8。
2.抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體，它由權利便要求1所述的雜交
瘤細胞株YQQD8分泌產生。
3.權利要求2所述的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體的制備方法，
其特征在于：步驟如下：將權利要求1所述的雜交瘤細胞株YQQD8注射預先用福氏不完全佐
劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素
通用單克隆抗體。
4.權利要求2所述的抗辣椒素、二氫辣椒素、合成辣椒素通用單克隆抗體在辣椒素、二
氫辣椒素、合成辣椒素總量測定中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：應用方法為...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李培武，楊青青，張奇，馬飛，張文，柯艷妮，張良曉，丁曉霞，張兆威，
申請(專利權)人：中國農業科學院油料作物研究所，
類型：發明
國別省市：湖北;42