新型抗-Fc-γ受體IIB抗體及其用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種抗-FcγRIIB抗體，與現(xiàn)有技術(shù)抗體相比，其顯著地增強(qiáng)了FcγRIIB的ITIM磷酸化并因此能夠用于自身免疫性疾病的治療或預(yù)防。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】
技術(shù)介紹
作為蛋白質(zhì)的免疫球蛋白基因超級(jí)家族的成員，F(xiàn)cγRII受體是由兩個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)長(zhǎng)度變化的胞漿結(jié)構(gòu)域組成的單一多肽鏈40kDa完整膜結(jié)合的糖蛋白。FcγRII受體在多種造血細(xì)胞上表達(dá)，是人血小板和巨核細(xì)胞上的唯一Fc-受體(Cassel,McKenzie,1993)。已知人的三種FcγRII受體，F(xiàn)cγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC，它們均結(jié)合IgG(例如以1-2x106M-1的親和性結(jié)合IgG1)或免疫復(fù)合物(IC，例如IgG調(diào)理的病原體)。FcγRIIA和FcγRIIB主要由于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的差異而互不相同，所述差異最終導(dǎo)致受體連接后的功能性異質(zhì)反應(yīng)。FcγRIIA觸發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞的活化(例如吞噬作用和呼吸爆發(fā))，而FcγRIIB起始抑制性信號(hào)，從而導(dǎo)致例如B細(xì)胞活化的抑制。FcγRIIC與FcγRIIB共享胞外結(jié)構(gòu)域，與FcγRIIA共享胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，從而在結(jié)合IgG或IC后傳遞活化信號(hào)。FcγRIIB在除T細(xì)胞和NK細(xì)胞以外的所有白細(xì)胞上表達(dá)，是在人B細(xì)胞上表達(dá)的唯一的抑制性Fc受體。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞共表達(dá)活化的FcγRIIA，而抑制性FcγRIIB受體和FcγRIIC在自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)上表達(dá)并構(gòu)成該類細(xì)胞上的唯一FcγR。已知FcγRIIB的兩種在生物學(xué)功能不同的同種型。FcγRIIB-1唯一地在B細(xì)胞上表達(dá)，而發(fā)現(xiàn)在IC結(jié)合后引起內(nèi)吞-/吞噬作用誘導(dǎo)的FcγRIIB-2在所有其他FcγRIIB表達(dá)細(xì)胞上表達(dá)(Nimmerjahn,Ravetch,2008)。FcγRIIB在胞外區(qū)中與FcγRIIA享有93％的同源性。如上所述，F(xiàn)cγRIIB與FcγRIIA之間的主要差異存在于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。FcγRIIB包含ITIM(基于免疫受體酪氨酸的抑制基序)，而FcγRIIA包含ITAM(基于免疫受體酪氨酸的活化基序)。通過(guò)IC結(jié)合的FcγRIIA簇集引起ITAM基序與引發(fā)ITAM基序(共有序列：Y-X2-L/I-X8-Y-X2-L/I，Isakov，1997)中酪氨酸殘基磷酸化的受體相關(guān)激酶的共定位以及隨后與激酶Syk相互作用，所述激酶Syk通過(guò)大量下游信號(hào)傳導(dǎo)和基因活化事件來(lái)引發(fā)細(xì)胞的活化(Ghazizadeh等,1994)。結(jié)合活性FcγRIIA的免疫球蛋白引起促炎性反應(yīng)，該促炎性反應(yīng)隨后導(dǎo)致病原體的去除，但在自身抗體的情況下，還可導(dǎo)致健康組織的破壞，從而達(dá)到病理性自體免疫疾病峰。因此，需要對(duì)抗體特異性的嚴(yán)格控制和否定性反饋系統(tǒng)來(lái)避免免疫系統(tǒng)對(duì)機(jī)體的異常破壞。所述抑制性FcγRIIB受體就是該否定性反饋系統(tǒng)的一部分。FcγRIIB的特征在于在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中存在ITIM基序(共有序列：V/I-X-Y-X2-V/L，Isakov，1997)，其在Ig-聚集體或IC結(jié)合和與攜帶ITAM的活化Fcγ受體共連接后被激酶Lyn磷酸化。經(jīng)磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5’-磷酸酶的SH2-結(jié)構(gòu)域(SHIP)，SHIP轉(zhuǎn)而水解磷酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FcγR-介導(dǎo)的酪氨酸激酶活化而釋放，因而阻止細(xì)胞內(nèi)Ca2+的流入。FcγRIIB交聯(lián)抑制對(duì)FcγR連接的活化反應(yīng)，其繼而抑制B細(xì)胞活化、增殖和抗體分泌。FcγRIIB具有兩種抑制活性。如上所述，其一依賴于ITIM基序并在FcγRIIB連接到攜帶ITAM的受體(例如FcγRIIA)時(shí)發(fā)生，導(dǎo)致ITAM觸發(fā)的鈣動(dòng)員和細(xì)胞增殖的抑制。這就意味著諸如脫粒作用、吞噬作用、ADCC、細(xì)胞因子釋放和促炎活化的鈣依賴性過(guò)程以及B細(xì)胞增殖都被FcγRIIB阻斷。FcγRIIB的第二種抑制活性包括B細(xì)胞上受體的同型聚集(FcγRIIB簇集)。同型聚集將促細(xì)胞凋亡信號(hào)遞送到細(xì)胞質(zhì)中，這可被FcγRIIB與B細(xì)胞受體(BCR)的連接所阻斷。多價(jià)-抗原結(jié)合后的BCR信號(hào)傳導(dǎo)的特征在于簇集的BCR通過(guò)Lyn(Src家族的一種激酶)磷酸化。這種Lyn作用下的磷酸化與BCR和被稱作“脂筏”的富含鞘脂和膽固醇的膜微結(jié)構(gòu)域的聯(lián)合一起發(fā)生。這些不溶的“脂筏”在免疫突觸的形成中起著重要作用。已觀察到，BCR與APC(抗原提呈細(xì)胞)上的抗原的相互作用致使在所接合的B細(xì)胞和APC的界面處形成該免疫突觸。FcγRIIB與BCR的共連接使BCR與脂筏的聯(lián)合去穩(wěn)定，隨后阻斷B細(xì)胞的免疫突觸的形成。BCR信號(hào)傳導(dǎo)的FcγRIIB抑制包含受體的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的ITIM中的酪氨酸殘基被激酶Lyn磷酸化以及隨后的肌醇磷酸酶SHIP的募集(Daeron等.,1995,RavetchandBolland,2001)?？茖W(xué)界接受這樣的觀點(diǎn)：FcγRIIB可被看作外周B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中較晚檢查點(diǎn)(checkpoint)，并且其還直接調(diào)節(jié)漿細(xì)胞存活。因此FcγRIIB被認(rèn)為是用于治療B細(xì)胞障礙、特別是B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的重要靶標(biāo)。在小鼠和人中的研究已經(jīng)闡明FcγRIIB對(duì)B細(xì)胞活性和體液耐受的影響，其中FcγRIIB表達(dá)的降低或缺少造成了明顯的自身免疫性疾病的發(fā)展或加劇。事實(shí)上，F(xiàn)cγRIIB在諸如原發(fā)免疫性血小板減少癥、全身性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、大皰性天皰瘡、尋常型天皰瘡和其他天皰瘡形式、B細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的多發(fā)性硬化癥的自身免疫性疾病以及其他以病原性免疫復(fù)合物發(fā)展為特征的自身免疫性疾病的發(fā)展和過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。在健康個(gè)體的免疫反應(yīng)期間，已經(jīng)進(jìn)入血液循環(huán)的病原體受到針對(duì)病原體生物體的表位的抗體(免疫球蛋白，Ig)的調(diào)理，并繼而導(dǎo)致所謂的免疫復(fù)合物的形成。這些免疫復(fù)合物隨后會(huì)被免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞)所吞噬，這導(dǎo)致病原體生物體從血液循環(huán)中被清除。另外已經(jīng)證明，F(xiàn)cγRIIB在外周耐受性方面也起著關(guān)鍵作用，因?yàn)镕cγRIIB敲除小鼠發(fā)展自發(fā)的自身免疫性疾病。FcγRIIB不足導(dǎo)致對(duì)誘發(fā)的自身免疫性疾病的易感性(Bolland和Ravetch，2000)。與健康人相比，在遭受自身免疫性疾病的患者中，F(xiàn)cγRIIB在B細(xì)胞上的表達(dá)通常會(huì)減弱或降低。然而例如幼稚B細(xì)胞顯示出正常的FcγRIIB表達(dá)，來(lái)自RA患者的記憶B細(xì)胞和漿母細(xì)胞則顯示出這一受體的表達(dá)降低(Catalán，2010)。Xiang及同事也能夠表明，在來(lái)自健康捐贈(zèng)者的漿母細(xì)胞上通過(guò)表面耦合的抗-FcγRIIB抗體2.4G2的FcγRIIB交聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(Xiang等，2007)基于上述的FcγRIIB在自身免疫性疾病中的顯著作用，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)該受體的抗體，以便治療或診斷患者。WO2009/08本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種抗FcγRIIB抗體，所述抗體包含：(i)與SEQ?ID?NO.20中所示的H?CDR1序列具有60％或更多同一性的H?CDR1序列，(ii)與SEQ?ID?NO.21中所示的H?CDR2序列具有36％或更多同一性的H?CDR2序列，(iii)與SEQ?ID?NO.22中所示的H?CDR3序列具有50％或更多同一性的H?CDR3序列，(iv)與SEQ?ID?NO.23中所示的L?CDR1序列具有64％或更多同一性的L?CDR1序列，(v)與SEQ?ID?NO.24中所示的L?CDR2序列具有29％或更多同一性的L?CDR2序列，和(vi)與SEQ?ID?NO.25中所示的L?CDR3序列具有78％或更多同一性的L?CDR3序列，其中，相比于未經(jīng)所述抗體處理的Daudi細(xì)胞，所述抗體使Daudi細(xì)胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增強(qiáng)約4至10倍。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2013.08.16 EP 13004094.21.一種抗FcγRIIB抗體，所述抗體包含：
(i)與SEQIDNO.20中所示的H-CDR1序列具有60％或更多同一性的H-CDR1序列，
(ii)與SEQIDNO.21中所示的H-CDR2序列具有36％或更多同一性的H-CDR2序列，
(iii)與SEQIDNO.22中所示的H-CDR3序列具有50％或更多同一性的H-CDR3序列，
(iv)與SEQIDNO.23中所示的L-CDR1序列具有64％或更多同一性的L-CDR1序列，
(v)與SEQIDNO.24中所示的L-CDR2序列具有29％或更多同一性的L-CDR2序列，和
(vi)與SEQIDNO.25中所示的L-CDR3序列具有78％或更多同一性的L-CDR3序列，
其中，相比于未經(jīng)所述抗體處理的Daudi細(xì)胞，所述抗體使Daudi細(xì)胞的FcγRIIB的
ITIM磷酸化增強(qiáng)約4至10倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體在其重鏈可變區(qū)中包含SEQIDNOs.29、30和
31中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其輕鏈可變區(qū)中包含SEQIDNOs.32、33和34
中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中與未經(jīng)所述抗體處理的Daudi細(xì)胞相比，所述抗體
使Daudi細(xì)胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增強(qiáng)約4至10倍。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體
(a)在其重鏈可變區(qū)中包含SEQIDNOs.14、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，
并且在其輕鏈可變區(qū)中包含SEQIDNOs.17、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或
者
(b)在其重鏈可變區(qū)中包含SEQIDNOs.20、21和22中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，
并且在其輕鏈可變區(qū)中包含SEQIDNOs.23、24和25中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，
其中與未經(jīng)所述抗體處理的Daudi細(xì)胞相比，所述抗體使Daudi細(xì)胞的FcγRIIB的ITIM
磷酸化增強(qiáng)約4至10倍。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是嵌合的或人源化的。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO.3中
所示的氨基酸序列，并具有選自下述的突變中的至少一個(gè)：位置1處的氨基酸Q被E替代，位
置11處的氨基酸V被L替代，位置42處的氨基酸G被K替代，位置50處的氨基酸S被V替代，位置
53處的氨基酸Y被S替代，位置58處的氨基酸K被T替代，位置61處的氨基酸G被A替代，位置75
處的氨基酸S被T替代，位置76處的氨基酸K被R替代，位置77處的氨基酸N被S替代，和位置78
處的氨基酸T被N替代。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：P·松德?tīng)柭?/a>，T·波爾，D·特米爾，A·卡爾，D·埃哈爾特，N·里特，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：蘇伯利莫爾公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：德國(guó);DE