單管中多重靶核酸的實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒技術

本發明專利技術實施例公開了一種單管中多重靶核酸的實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒，其包括在所述單個PCR反應管中混合樣本核酸，Tth?DNA聚合酶，H-Taq?DNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，內標，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探針，以及內標上下游引物和探針，針對所述的各種探針標記有熒光基團和熒光淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的檢測波長不同；所述內標是競爭性內標，其與HIV共用所述HIV的上下游引物。本發明專利技術的能夠檢測HIV、HCV、HBV三種常見血液傳染病毒的各種基因型別，同時降低成本，提高儀器使用率，滿足血液中心檢測要求。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于核酸檢測
，涉及在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中靶核酸的PCR方法，具體涉及一種單管中多重靶核酸的實時熒光檢測PCR方法以及檢測試劑盒。
技術介紹
自1971年開始HBsAg作為常規篩查項目引入到血液篩查，使得輸血后感染乙肝的發生率大大降低，但每年仍有少量新發輸血后肝炎病例報道。例如美國無償獻血者每單位供血傳播HBV的危險性為1/6.3萬。這些危險主要來自HBV“窗口期”、病毒變異、低病毒載量感染等。間接酶聯免疫法(ELISA)篩查并不能從根本上排除病毒存在的危險，由于HBV感染后病毒顆粒先于HBsAg釋放到血液中，在約50天的“窗口期”內，感染者的HBsAg檢測呈陰性，但是其血液卻具傳染性。而使用核酸檢測(Nucleicacidtest，NAT)技術能提前20天篩查出HBsAg陰性、HBV-DNA陽性獻血者。隨著血液制品在世界范圍的流通，HCV感染呈世界性分布，為了控制丙型肝炎病毒的血液傳播，世界各國均開展了對獻血員抗-HCV的檢測。常用的抗-HCV診斷試劑采用間接酶聯免疫法(ELISA)，第一代抗-HCVELISA采用的抗原C100-3是HCV非結構基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表達的融合蛋白，靈敏度低，漏檢率較高；第二代抗-HCVELISA在第一代基礎上增加了核心區重組蛋白C22和NS3區重組蛋白C33c，雖然在靈敏度和特異性上有很大改善，但仍不能排除由于重組融合蛋白帶來的少數假陽性和極少數的漏檢。目前我國多采用第三代抗-HCVELISA試劑，其包被抗原為HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5抗原，特異性超過99％，雖然目前缺乏判斷其敏感性的金標準，但對于免疫功能正常的HCV-RNA陽性感染者，抗-HCV檢出率也高于99％。HCV感染后一般到抗體轉陽有一個較長的窗口期，平均為70天，有的患者窗口期可延長至6-9月或更長，約1％-3％的患者抗-HCV可持續陰性，而基因組的復制出現得很早，感染后數天即出現病毒血癥。已有輸血后即有丙型肝炎病毒感染發生的報道，這表明抗-HCV陰性的獻血員中有少數存在丙型肝炎病毒輸血傳播的可能性。人類獲得性免疫缺陷綜合癥簡稱艾滋病，是由一種存在于血液中并攻擊免疫系統的病毒引起的。據WHO估計，我國艾滋病感染人數到2010年將達到1000萬，并持續高速增長。血液傳播是艾滋病毒傳播的重要途徑之一。全球每年增加560萬艾滋病毒攜帶者，有5％至10％的人是經過輸血或血液制品而感染的。根據所采用的檢測方法的靈敏度不同，感染窗口期的長短不同。采用核酸測定方法，HIV的感染窗口期為11天；采用第3代EIA試劑盒，HIV的感染窗口期為22天；采用第4代EIA試劑盒，HIV的感染窗口期為18天。由于空白窗口期的存在，即使未來技術的靈敏度足以消除感染窗口期，仍然無法將HIV感染的窗口期縮短為零。目前，在臨床上篩選各種血源性傳播疾病的方法，主要是免疫學診斷方法。盡管隨著第三代單克隆診斷抗體的出現，在很大程度上增加了篩查和檢測的靈敏度，并在一定程度上減少了血源傳播病毒性疾病的概率。但由于受免疫學診斷方法的靈敏度及其與生俱來的限制，依然不能完全杜絕陽性病毒血樣的漏檢，漏檢率較高。其主要原因在于，免疫學診斷主要依賴抗原抗體介導的免疫反應，而病毒感染機體后，機體產生可檢測水平的高滴度抗體的需要一段相對較長的時間。另外，由于個體免疫機能不同，其中有少數感染者感染后機體所產生的抗體滴度有可能低于免疫學檢測線一下，甚至不產生抗體。因此，免疫學診斷方法不能檢測出處于窗口期和新近感染病毒的獻血員，這樣勢必導致漏檢。其次，抗原出現變異以及稀有亞型也可導致漏檢，因此，免疫學篩查后，輸血相關疾病傳播依然存在一定的概率。目前免疫學檢測以上三種病毒的平均窗口期分別為：HBV56天，HCV70天，HIV22天。近5年來，隨著以核酸檢測(Nucleicacidtest，NAT)為代表的分子生物學技術在血液篩查方面的應用，輸血及血制品安全性有了很大的提高。在理論上，NAT技術能夠顯著的縮短病原體檢出的窗口期。另外，NAT技術靈敏度和特異性均較顯著的高于免疫學方法。核酸檢測HBV，HCV，HIV病毒的窗口期較抗體檢測分別提前：9天、25天、14天。而應用NAT技術篩查獻血員，相應的可將獻血員傳播以上病毒性疾病的概率分別降低42％、72％和50％。但是現有的核酸檢測技術具有以下缺點：(1)以諾華診斷的TMA方法以及羅氏診斷等采用單管檢測，但是不能區分HBV，HCV及HIV-1病毒種類，根據中國國情，如血液中心檢測到HIV-1反應性樣本，需報當地疾病預防控制中心做確診檢測，因此血液中心還需要采購這些廠家的病毒種類檢測試劑，增加了成本；(2)以達安基因，科華生物為代表的采用三管檢測技術，會限制檢測通量。例如，同樣采用96孔的PCR儀器，科華需要三個孔才能檢測一個樣本，整機不計算對照樣品最多檢測32個樣本，試劑整體的成本也較高；另外核酸提取模板要分成三份分別檢測，試劑靈敏度受影響較大，尤其是針對隱匿性乙肝造成潛在漏檢風險。
技術實現思路
為了解決以上技術問題，本專利技術實施例中提供了一種單管中多重靶核酸的實時熒光檢測PCR方法，每種病毒靶核酸分別是HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA，其包括如下步驟：(1)在單個PCR反應管中混合樣本核酸，TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，內標，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探針，以及內標探針，針對所述的各種探針標記有熒光基團和熒光淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的檢測波長不同；其中，所述HBV-DNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:15’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；所述HBV-DNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:25’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；所述HBV-DNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:35’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；所述HCV-RNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:45’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；所述HCV-RNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:55’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；所述HCV-RNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:65’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；所述HIV-1-RNA上游本文檔來自技高網...

【技術保護點】
單管中多重靶核酸的實時熒光檢測PCR方法，每種病毒靶核酸分別是HBV?DNA，HCV?RNA和HIV?1?RNA，其特征在于，包括如下步驟：(1)在所述單個PCR反應管中混合樣本核酸，Tth?DNA聚合酶，H?Taq?DNA聚合酶，Mn(OAc)2，dNTPs，內標，HBV?DNA、HCV?RNA以及HIV?1?RNA的上下游引物和探針，以及內標上下游引物和探針，針對所述的各種探針標記有熒光基團和熒光淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的檢測波長不同；其中，所述HBV?DNA上游引物的堿基序列為：SEQ?ID?NO:15’?TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC?3’；所述HBV?DNA下游引物的堿基序列為：SEQ?ID?NO:25’?AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA?3’；所述HBV?DNA探針的堿基序列為：SEQ?ID?NO:35’?TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA?3’；所述HCV?RNA上游引物的堿基序列為：SEQ?ID?NO:45’?AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG?3’；所述HCV?RNA下游引物的堿基序列為：SEQ?ID?NO:55’?GGTGTACTCACCGGTTCCG?3’；所述HCV?RNA探針的堿基序列為：SEQ?ID?NO:65’?CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT?3’；所述HIV?1?RNA上游引物的堿基序列為：SEQ?ID?NO:75’?CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG?3’；所述HIV?1?RNA下游引物的堿基序列為：SEQ?ID?NO:85’?CCAGAGAGCTCCCAGGCTC?3’；所述HIV?1?RNA探針的堿基序列為：SEQ?ID?NO:95’?TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT?3’；所述內標探針的堿基序列為：SEQ?ID?NO:105’?AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG?3’；所述內標的擴增子序列的堿基序列為：SEQ?ID?NO:115’?CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGTTGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG?3’；(2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；(3)選擇FAM通道檢測HIV?1RNA，ROX通道檢測HCV?RNA，CY5通道檢測HBV?DNA；根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有HBV?DNA，HCV?RNA和HIV?1?RNA中的一種或幾種病毒靶核酸存在于樣品。...

【技術特征摘要】
1.單管中多重靶核酸的實時熒光檢測PCR方法，每種病毒靶核酸分別是HBV-DNA，HCV-
RNA和HIV-1-RNA，其特征在于，包括如下步驟：
(1)在所述單個PCR反應管中混合樣本核酸，TthDNA聚合酶，H-TaqDNA聚合酶，Mn
(OAc)2，dNTPs，內標，HBV-DNA、HCV-RNA以及HIV-1-RNA的上下游引物和探針，以及內標上下
游引物和探針，針對所述的各種探針標記有熒光基團和熒光淬滅基團，而且各種探針標記
的熒光基團的檢測波長不同；其中，
所述HBV-DNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:1
5’-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3’；
所述HBV-DNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:2
5’-AGAGTAACTCCACAGWAGCTCCAA-3’；
所述HBV-DNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:3
5’-TTGGGTGGCTTTGGGGCATGGA-3’；
所述HCV-RNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:4
5’-AGTGTCGTRCAGCCTCCAGG-3’；
所述HCV-RNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:5
5’-GGTGTACTCACCGGTTCCG-3’；
所述HCV-RNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:6
5’-CCCCCTCCCGGGAGAGCCAT-3’；
所述HIV-1-RNA上游引物的堿基序列為：SEQIDNO:7
5’-CCTCAGATGCTGCATAWAAGCAG-3’；
所述HIV-1-RNA下游引物的堿基序列為：SEQIDNO:8
5’-CCAGAGAGCTCCCAGGCTC-3’；
所述HIV-1-RNA探針的堿基序列為：SEQIDNO:9
5’-TGTACTGGGTCTCTCTDGTTAGACCAGAT-3’；
所述內標探針的堿基序列為：SEQIDNO:10
5’-AACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACG-3’；
所述內標的擴增子序列的堿基序列為：SEQIDNO:11
5’-CCTCAGATGCTGCATATAAGCAGTTCCAAGTTGTAAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGTTCCAAGT
TGTAGAGCCTGGGAGCTCTCTGG-3’；
(2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；
(3)選擇FAM通道檢測HIV-1RNA，ROX通道檢測HCV-RNA，CY5通道檢測HBV-DNA；根據熒光
檢測結果計算出的Ct值判斷是否有HBV-DNA，HCV-RNA和HIV-1-RNA中的一種或幾種病毒靶
核酸存在于樣品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述內標是競爭性內標，其與HIV共用所述
HIV-1-RNA的上下游引物。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述內標包含在人造病毒顆粒內。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述各種探針標記有不同的熒光基團。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應條件為：...

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴立忠，龔小鵬，鄧中平，羅惠賓，文荻琛，
申請(專利權)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：湖南;43