一種電化學DNA生物傳感器及其應用制造技術

一種電化學DNA生物傳感器及其應用。該生物傳感器經玻碳電極、二氧化錳納米顆粒分散液層、探針DNA溶液層；經由納米二氧化錳的制備、二氧化錳|殼聚糖|玻碳電極的制備、及修飾電極單鏈DNA|二氧化錳|殼聚糖|玻碳電極的制備步驟得到；與目標DNA雜交后，采用三電極體系，利用電化學阻抗譜檢測玻碳電極修飾前后表面電子傳遞阻值變化，作為檢測信號檢測目標DNA。該電化學DNA生物傳感器用于捕食線蟲真菌少孢節叢孢(A.oligospora)菌種鑒定。優點在于：電化學DNA生物傳感器簡單，易于操作，電極具有良好的選擇性，探針DNA具有良好的特異性，能夠用于捕食線蟲真菌少孢節叢孢(A.oligospora)菌種鑒定。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種電化學DNA生物傳感器及其應用，屬于DNA生物傳感器領域。
技術介紹
植物寄生線蟲會引起植物病害，是植物主要病源之一。美國每年因植物寄生線蟲造成作物減產金額可超過1.57億美元(1)。在我國，根結線蟲、松材線蟲和胞囊線蟲是主要植物寄生線蟲病害，導致作物大量減產，限制了我國農林業的發展(2)。過去對線蟲的防治主要依靠化學殺蟲劑，但長期使用化學殺蟲劑造成環境污染，作物產量沒有得到很好的改善。同時毒素殘留進而影響到動植物，甚至是人類的健康。近十年，生物防治線蟲得到了各國政府的重視，從不污染環境、經濟實惠等目標著手，開展了各種試驗項目。捕食線蟲真菌作為病原線蟲的重要天敵，是自然界中控制和調節線蟲種群數量的重要生物因子，也是研究開發生物殺線蟲制劑的主要來源(3)。在土壤中約有200多種真菌利用捕食器官來捕食線蟲。通過近距離的接觸線蟲，真菌菌絲能在幾小時后形成捕食器官黏附、穿透、殺死后消化線蟲。這些分化的器官包括三維菌網、粘性分支、粘球和收縮環等(4)。少孢節叢孢(Arthrobotrysoligospora)是捕食線蟲真菌的模式種，通過形成三維菌網捕食線蟲。它分布廣、全基因組信息完整，是用于控制植物和動物線蟲的潛在生防菌(5)。因此在環境中快速和特異性地檢測少孢節叢孢是很重要的。過去，對于菌株的鑒定多采用形態學方法。隨著分子技術的發展，已從經典的表型特征的鑒定深入到現代的遺傳學特性的鑒定、細胞化學組分的精確分析以及利用電子計算機進行數值分類研究等新的層次上。真核生物基因組中編碼核糖體的基因18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個轉錄單元，三者高度保守，適合于較高等級水平的生物群體間的系統分析。其中的間隔區為內轉錄間隔區(InternalTranscribedSpacer,ITS)，包括ITS1及1TS2兩部分，由于進化相對迅速而具多態性，因而適合于等級水平較低的系統學研究(6)?；谏鲜隼碚?，本專利技術提供一種電化學DNA生物傳感器及其應用。參考文獻：1.AbadP,GouzyJ,etal.(2008)Genomesequenceofthemetazoanplant-parasiticnematodeMeloidogyneincognita.Nat.Biotechnol.26:909-15.2.JuanLi,ChenggangZou,etal.(2015)MolecularMechanismsofNematode-NematophagousMicrobeInteractions:BasisforBiologicalControlofPlant-ParasiticNematodes.Annu.Rev.Phytopathol.53:67-953.Nordbring-HertzB,JanssonHB,TunlidA.(2000)Nematophagousfungi.In:EncyclopediaofLifeScience.MacmillamPublishersLtd.,Basingtoke.4.Yang,J.,Wang,L.,Ji,X.,Feng,Y.,Li,X.,Zou,C.G.,Xu,J.P.,Ren,Y.,Mi,Q.L.,Wu,J.L.,Liu,S.Q.,Liu,Y.,Huang,X.W.,Wang,H.Y.,Niu,X.M.,Li,J.,Liang,L.M.,Luo,Y.L.,Ji,K.F.,Zhou,W.,Yu,Z.F.,Li,G.H.,Liu,Y.J.,Li,L.,Qiao,M.,Feng,L.,andZhang,K.Q.(2011)GenomicandproteomicanalysesofthefungusArthrobotrysoligosporaprovideinsightsintonematode-trapformation.PLoSPathog7(9):e1002179.5.Meerupati,T.,Andersson,K.M.,Friman,E.,Kumar,D.,Tunlid,A.,&Ahrén,D.(2013)Genomicmechanismsaccountingfortheadaptationtoparasitisminnematode-trappingfungi.PLoSGenet,9(11),e1003909.6.燕勇，李衛平等。(2008)rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應用。中國衛生檢驗雜志，第18卷第10期：1958-1960。
技術實現思路
本專利技術的目的在于：針對捕食線蟲真菌少孢節叢孢(A.oligospora)的ITS1部分序列，設計了特異性的DNA探針，提供了一種快速、便捷的DNA電化學生物傳感器及其應用。同時以一個錯配的和完全不匹配的目標DNA序列對其進行了特異性檢測，證明了該DNA生物傳感器的特異性。本專利技術的電化學DNA生物傳感器從內到外依次包括：玻碳電極、二氧化錳納米顆粒分散液層、探針DNA溶液層；經由如下步驟得到：(1)納米二氧化錳(MnO2)的制備將乙酸錳四水合物和高錳酸鉀按照3:2摩爾比，加入到瑪瑙研缽中研磨40分鐘。待反應完全后，經80℃水浴6小時，用無水乙醇和超純水依次洗滌該粉末。循環3次。最后，在105℃干燥箱中干燥，即可得納米二氧化錳顆粒。(2)二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極的制備配制0.05mol/L醋酸溶液。按照每100mL醋酸溶液中溶有0.5g的殼聚糖，加入殼聚糖，混合均勻后形成殼聚糖溶液。將步驟1中制備好的納米二氧化錳顆粒加入殼聚糖溶液中，使得二氧化錳與殼聚糖的質量比為1:100。超聲2小時后，形成二氧化錳顆粒的殼聚糖溶液。將玻碳電極打磨光亮，清洗干凈后，在其表面滴上5μL混有納米二氧化錳顆粒的殼聚糖溶液，在干燥箱中烘干，再用超純水清洗玻碳電極表面，即可得二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極。(3)單鏈DNA|二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極的制備在NCBI網站的核酸庫中找到所有包含少孢節叢孢(A.Oligospora)的18SrDNA到28SrDNA范圍的序列信息，選擇其中一條序列，進行Blast比對。得到結果圖后，找到圖中共有區域，挑選含有高度保守區的片段，即可得到特異性的ITS1序列。該序列長度為69個堿基，命名為目標DNA。根據基因堿基互補配對原則，設計了此目標DNA的探針，命名為探針DNA。該探針的序列(SEQIDNO:1)為：5＇-AAACCTGCCCCTTGCGGGGAGGCGGGTGCTGGCTTACCAACCGGAAGACAGCGCAAACCGCTCTTTCGA-3＇將已合成的探針DNA配制成DNA溶液，使其濃度達到2μmol/L。取5μL的探針DNA(2μmol/L)溶液滴加到步驟2中制備好的二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極表面，在干燥箱中烘干，取出后用超純水清洗。即得到單鏈DNA修飾的電極，命名為單鏈DNA|二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極。(4)DNA的雜交待雜交的三種目標DNA具體為：(a)與探針DNA堿基完全互補配對的目標DNA，該序列全長69個堿基，具體為(SEQIDNO:2)：5＇-TCGAAAGAGCGGTTTGCGCTGTCTTCCGGTTGGTAAGCCAGCACCCGCC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種電化學DNA生物傳感器，其特征在于該生物傳感器從內到外依次包括：玻碳電極、二氧化錳納米顆粒分散液層、探針DNA溶液層；經由如下步驟得到：(1)納米二氧化錳的制備將乙酸錳四水合物和高錳酸鉀按摩爾比3:2，加入到瑪瑙研缽中研磨20?80分鐘后，經80℃水浴6小時，用無水乙醇和超純水依次洗滌該粉末，循環3次，最后，在105℃干燥箱中干燥，即得納米二氧化錳顆粒；(2)二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極的制備配制0.05mol/L醋酸溶液。按照每100mL醋酸溶液中溶有0.5g的殼聚糖，加入殼聚糖，混合均勻后形成殼聚糖溶液；將步驟1中制備好的納米二氧化錳顆粒加入殼聚糖溶液中，使得二氧化錳與殼聚糖的質量比為1:100；超聲2小時后，形成二氧化錳顆粒的殼聚糖溶液；將玻碳電極打磨光亮，清洗干凈后，在其表面滴上5μL混有納米二氧化錳顆粒的殼聚糖溶液，在干燥箱中烘干，再用超純水清洗玻碳電極表面，即得二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極；(3)單鏈DNA|二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極的制備設計了能檢測少孢節叢孢的探針基因，命名為探針DNA。該探針的序列為SEQ?ID?NO:1：5＇?AAA?CCT?GCC?CCT?TGC?GGG?GAG?GCG?GGT?GCT?GGC?TTA?CCA?ACC?GGA?AGA?CAG?CGC?AAA?CCG?CTC?TTT?CGA?3＇；將已合成的探針DNA配制成DNA溶液，使其濃度達到2μmol/L；取5μL的探針DNA(2μmol/L)溶液滴加到步驟2中制備好的二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極表面，在干燥箱中烘干，取出后用超純水清洗。即得到DNA探針電極，命名為單鏈DNA|二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極。...

【技術特征摘要】
1.一種電化學DNA生物傳感器，其特征在于該生物傳感器從內到外依次包括：玻碳電極、二氧化錳納米顆粒分散液層、探針DNA溶液層；經由如下步驟得到：(1)納米二氧化錳的制備將乙酸錳四水合物和高錳酸鉀按摩爾比3:2，加入到瑪瑙研缽中研磨20-80分鐘后，經80℃水浴6小時，用無水乙醇和超純水依次洗滌該粉末，循環3次，最后，在105℃干燥箱中干燥，即得納米二氧化錳顆粒；(2)二氧化錳|殼聚糖|玻碳修飾電極的制備配制0.05mol/L醋酸溶液。按照每100mL醋酸溶液中溶有0.5g的殼聚糖，加入殼聚糖，混合均勻后形成殼聚糖溶液；將步驟1中制備好的納米二氧化錳顆粒加入殼聚糖溶液中，使得二氧化錳與殼聚糖的質量比為1:100；超聲2小時后，形成二氧化錳顆粒的殼聚糖溶液；將玻碳電極打磨光亮，清洗干凈后，在其表面滴上5μL混有納米二氧化錳顆粒的殼聚糖溶液，在干...

【專利技術屬性】
技術研發人員：屈慶，陳瑩，李蕾，張克勤，
申請(專利權)人：云南大學，
類型：發明
國別省市：云南;53