人外周血染色體同步化制備試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種人外周血染色體同步化制備試劑盒，所述試劑盒包括胸苷、2’?脫氧胞苷、秋水仙素、1640培養基、固定液。本發明專利技術試劑盒將外周血淋巴細胞的生長周期同步化，能夠獲得足夠多的500?550條帶紋的染色體核型，有利于對染色體畸變和微小異常結構更精確的識別。本發明專利技術的同步化試劑盒采用過量胸苷單次阻斷、脫氧胞苷釋放、乙醇乙酸收獲，不僅提高了分辨率，而且操作步驟簡單，減少了毒性試劑的接觸頻率，適宜于廣泛常規應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫療器械領域，具體涉及一種人外周血染色體同步化制備試劑盒。
技術介紹
染色體是組成細胞核的基本物質，是基因的載體，由染色體數目異常和/或結構畸變所導致的疾病稱為染色體病，它構成了人類遺傳性疾病的一大類，目前已經發現的人類染色體數目異常和結構畸變2萬多種，染色體綜合征200多種，這些是造成流產、死胎、先天性發育異常、兩性畸形的主要原因之一。細胞培養、染色體制備后核型分析是發現染色體病經典的細胞遺傳學技術，而外周血是染色體分析應用最多的標本。體外培養的外周血淋巴細胞處在G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。當在培養基中加入植物凝集素(PHA)時，小淋巴細胞受到刺激后轉化成為能進行有絲分裂的淋巴母細胞，并進行有絲分裂。經過短期培養后，在秋水仙素(紡錘體抑制劑)作用下，淋巴母細胞有絲分裂停滯，從而獲得大量處于有絲分裂中期的淋巴細胞，制片后可以清楚地對染色體進行觀察與分析。染色體核型分析是細胞遺傳學基礎，其準確性依賴于染色體的分辨率，染色體愈長帶紋愈豐富，分辨率越高(如處于晚前期、前中期和早中期的細長染色體，顯帶數可增至550條、850條甚至1000條以上)。高分辨的核型分析技術染色體帶紋可以達800多條，但是整個實驗過程操作繁瑣，對閱片人員的技術要求高，耗時費力，不可能作為臨床常規應用。目前，我國外周血染色體制備常規法G顯帶標準為320～400條帶，但常常造成很多異常結構的誤診和漏診。要得到更多條帶的染色體，需獲得大量處于分裂早中期的細胞；若同時要求該技術簡單、具有可操作性，這在普通培養的常規法中難以實現。
技術實現思路
為解決以上技術問題，本專利技術提出一種人外周血染色體同步化制備試劑盒，簡單易操作，能夠將外周血淋巴細胞的生長周期同步化，從而獲得足夠多的500-550條帶紋的染色體核型，有利于對染色體畸變和微小異常結構更精確的識別。為實現以上目的，本專利技術的技術方案為：人外周血染色體同步化制備試劑盒，包括胸苷、2’-脫氧胞苷、秋水仙素、1640培養基、固定液。其中，所述胸苷的濃度為10mg/ml。其中，所述脫氧胞苷的濃度0.08mg/ml。其中，所述秋水仙素的濃度是10ug/ml。其中，所述固定液的組成為：乙醇∶乙酸＝3∶1。其中，所述胸苷在使用時的終濃度為0.3mg/ml。其中，所述脫氧胞苷在使用時的終濃度為3ug/ml。其中，所述秋水仙素在使用時的終濃度為2ug/ml。本專利技術試劑盒的使用步驟如下：1.取血：消毒皮膚，于肘靜脈采血約5ml至肝素鈉的抗凝管，輕輕搖勻。在酒精燈火焰旁，將抗凝管內的外周血接種于含有1640培養基的離心管中，每管28-30滴(用5ml的注射器的7號黑色針頭垂直滴加)。接種后輕輕水平搖動混勻。2.細胞培養：將離心管置于特制試管架，45度傾斜于培養箱內，密閉式培養66-72小時。外周血淋巴細胞培養環境的溫度為37℃±0.5℃，每隔24小時左右輕搖1次，以促進細胞生長增殖。3.阻斷：在收獲的前一天下午、無菌條件下加入10mg/ml胸苷180ul至培養基(胸苷終濃度達到0.3mg/ml)，充分混勻后放回37℃培養箱繼續培養，保證阻斷時間16-18h。4.釋放：收獲當天上午于無菌條件下加入0.08mg/ml脫氧胞苷225ul至培養基(脫氧胞苷終濃度達到3ug/ml)，輕輕搖勻放回37℃恒溫箱繼續培養5h。5.秋水仙素處理：終止培養前18min加入10ug/ml秋水仙素1.2ml至培養基(秋水仙素最終濃度為2ug/ml)。6.低滲處理：秋水仙素處理完畢后，小心地從培養箱取出離心管直接離心10min，轉速1500rpm。吸掉上清液，然后加入37℃溫育的0.075mol/L的KCl低滲溶液8ml，用吸管吹打成細胞懸液，置37℃水浴處理30min。7.預固定：在每個離心管中加入1ml的固定液(乙醇∶乙酸＝3∶1)，繼續37℃水浴5min后，1500rpm10min離心，棄上清液。8.固定：在離心管中加入固定液8ml，立即用吸管輕輕吹打成單個細胞懸液，固定30min后離心1500rpm10min，棄上清液。9.再固定：重復第8步兩次。10.制片：在離心管中滴入新固定液0.2毫升，用吸管將淋巴細胞團輕輕吹打成細胞懸液，從冰箱的冷凍室內取出冰片，每片滴加懸液1-2滴，80℃烤2.5小時。11.染色：用0.025％胰酶消化后用Giemsa染液染色(消化時間和染色時間因環境變化有差別，因此每次顯帶染色應進行預實驗)，然后用鑷子夾出玻片，用自來水輕輕沖洗兩面，室溫干燥或電吹風吹干。12.鏡檢分析：待玻片干后，在顯微鏡下檢查。用北昂染色體圖像分析系統計數并分析。本專利技術試劑盒中的胸苷用于阻斷DNA合成，利用過量胸苷能阻礙DNA合成的原理，在實驗中加入胸苷阻斷18小時，可逆地抑制DNA合成，此時間為外周血淋巴細胞G2、M和G1期時間的總和或稍長，使得多數細胞同步化于G1/S期邊界。本專利技術試劑盒中的脫氧胞苷用于釋放，釋放時間不短于S期時間，使得所有位于G1/S期的細胞通過S期，又不使周期前進最快的細胞進入下一個S期。細胞在阻斷和釋放的共同作用下，能夠獲得較多處于晚前期、前中期及早中期的染色體。秋水仙素在破壞紡錘體的時候積累大量中期分裂相，同時使染色體長度適于分析，但實驗時需要找到時間和濃度的平衡點。如果處理時間太長、濃度高，則核型多、但染色體短、形態模糊；如處理時間太短、濃度低，則染色體長、但分裂相少。本專利技術試劑盒中秋水仙素的使用濃度為2ug/ml，這樣的濃度可縮短作用時間至18min，在保證了足夠數量分裂相的同時，又獲得了大量長度適合、形態好的染色體。而常規方法中秋水仙素需作用2-4小時，使整個實驗的時間大大延長。本專利技術采用乙醇∶乙酸＝3∶1的混合溶液為固定液，避免了常用卡諾固定液的毒害作用。常規法采用1體積冰醋酸和3體積甲醇混合而成的卡諾固定液，其中的甲醇有較強的毒性，它經消化道、呼吸道或皮膚攝入都會產生毒性反應。本專利技術采用無毒無害的乙醇替代甲醇，不僅沒有毒性，而且在實驗結果上也取得了理想的結果。本專利技術采用過量胸苷單次阻斷、脫氧胞苷釋放，所獲得的大多數分裂相為500條帶左右，彌補了常規方法的不足。本專利技術術語解釋如下。染色體：細胞核內能夠被堿性燃料著色的棒狀結構，是遺傳基因的載體，主要由蛋白質和核酸所構成。染色體病：由染色體數目和/或結構異常所導致的疾病稱為染色體病。同步化：使用藥物，使細胞停留在細胞周期的某個時相。PHA(phytohemagglutinin)：即植物血凝素，是一種有絲分裂原，激活小淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，繼而分裂增殖。秋水仙素：一種生物堿，能夠抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。其作用和濃度、時間有關，處理時要兼顧二者。固定：將細胞、組織成分選擇性地固定于某一特定階段的過程。目的在殺死細胞的同時避免所研究的成分受到破壞。就細胞遺傳學研究而言，目的在于提高染色體結構的可見性和顯示染色體形態的細節。胸苷：過量胸苷可逆地抑制DNA合成，使得多數細胞同步化于G1/S期邊界。脫氧胞苷：將同步化于G1/S期邊界的細胞釋放，有利于細胞快速合成DNA。本試劑盒中的胸苷和脫氧胞苷將外周血淋巴細胞的生長周期同步化，能夠獲得足夠多的500-550本文檔來自技高網...

【技術保護點】
人外周血染色體同步化制備試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括胸苷、2’?脫氧胞苷、秋水仙素、1640培養基、固定液。

【技術特征摘要】
1.人外周血染色體同步化制備試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括胸苷、2’-脫氧胞苷、秋水仙素、1640培養基、固定液。2.按照權利要求1所述的人外周血染色體同步化制備試劑盒，其特征在于，所述胸苷的濃度為10mg/ml。3.按照權利要求1所述的人外周血染色體同步化制備試劑盒，其特征在于，所述脫氧胞苷的濃度0.08mg/ml。4.按照權利要求1所述的人外周血染色體同步化制備試劑盒，其特征在于，所述秋水仙素的濃度是10ug/ml。5.按照...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張建林，李海波，張玉泉，李紅，王挺，楊益梅，王珊珊，張俊榮，姚鋒，
申請(專利權)人：南通大學附屬醫院，蘇州市立醫院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32