一種生產低聚果糖的固定化細胞及其制備方法與應用技術

本發明專利技術涉及一種生產低聚果糖的固定化細胞及其制備方法與應用。制備方法包括以下步驟：(1)向低聚果糖產生菌的菌懸液中加入戊二醛，反應，經洗滌，制得交聯菌體；(2)取交聯菌體配制交聯菌體懸液，然后與固定液混合，將混合后的料液加入到氯化鈣溶液中，硬化，固液分離，制得固定化細胞。本發明專利技術首次先采用戊二醛對細胞進行處理，然后用PEG600造孔和海藻酸鈣凝膠包埋，并在糖化過程中補充氯化鈣，最后獲得了酶活穩定性好、傳質效率高、連續使用3個月酶活仍高于70％的固定化細胞。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種生產低聚果糖的固定化細胞及其制備方法與應用，屬于細胞固定化

技術介紹
低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)是指果糖基經β-2,1糖苷鍵連接而成的聚合度為2～9的功能性低聚糖，屬于食品配料。按結構，低聚果糖可分為蔗-果型和果-果型兩種。工業上生產低聚果糖主要有兩種方法：以菊粉為原料的酶水解法和以蔗糖為原料的酶轉化法。前者所得低聚果糖聚合度范圍較大(DP2-DP9)，屬果-果型；后者所得低聚果糖聚合度范圍較小(DP3-DP6)，屬蔗-果型。研究顯示，動物或人體攝食低聚果糖，可改善腸道菌群、減輕便秘癥狀、改善脂質代謝、抑制腸道腐敗、促進鈣鎂等礦質元素的吸收、增強免疫力等。低聚果糖良好的理化特性和生理功效，使其在食品、保健品、飼料等行業中得到了廣泛應用。工業上以蔗糖為原料生產低聚果糖的方法有微生物液體深層發酵法、游離酶法和固定化酶法。微生物液體深層發酵法是一種傳統的方法，其生產工藝成熟，是早期低聚果糖生產上通用的方法，該法設備投入較大，且微生物菌體只能利用一次；游離酶法生產工藝簡單，但酶只能利用一次且酶制劑成本較高；固定化酶法可實現酶的多次利用，但酶的固定化過程技術要求較高，酶經固定化后轉化蔗糖所得低聚果糖的含量往往低于游離酶。除上述生產方法外，尚有固定化細胞法，該法的優點是可實現微生物菌體的重復利用。相比于固定化酶法，該法省去了酶的提取純化等繁雜的過程，固定化成本較低。固定化細胞法生產低聚果糖，國外有成功的案例，國內鮮有成功應用的報道。中國專利文獻CN104450665A(申請號201410720356.2)公布了一種固定紅發夫酵母及制備新科斯糖(低聚果糖的一種)的方法及應用。用海藻酸鈣凝膠包埋紅發夫酵母，所得固定化顆粒經洗滌后，轉到殼聚糖溶液中覆膜，所得固定化細胞機械強度和穩定性等得以提高。但是酵母經海藻酸鈣包埋后再覆以殼聚糖凝膠，其傳質效率降低。中國專利文獻CN105112473A(申請號201510649367.0)公開了一種低聚果糖——新科斯糖的生產工藝，該法是利用固定化法夫酵母轉化蔗糖來制備新科斯糖。中國專利文獻CN101974508A(申請號201010297075.2)公開了一種固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶及其制備方法和應用，首先在酶液中加入分子篩，其次加入戊二醛使混合液交聯，然后經海藻酸鈉和氯化鈣的包埋，得到固定化的環糊精葡萄糖苷轉移酶。本專利技術所制得的固定化環糊精葡萄糖苷轉移酶具有較高熱穩定性和貯存穩定性，同時可采用粗酶液進行固定化，大大降低了固定化的成本，所述固定化酶可用于2-O-葡萄糖基抗壞血酸的生產，轉化率高達0.22g·L-1·h-1，轉化結束后產物易于提取，固定化酶也便于回收，還可重復利用。但由于該專利固定化的目標為酶，該酶經分子篩吸附與戊二醛交聯后，再經海藻酸鈣凝膠包埋，傳質效率降低；且在應用過程中，凝膠顆粒隨著使用次數的增加會逐漸變得松軟，給工業化生產帶來不便。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術的不足，提供一種生產低聚果糖的固定化細胞及其制備方法與應用。本專利技術技術方案如下：一種生產低聚果糖的固定化細胞的制備方法，包括以下步驟：(1)向低聚果糖產生菌的菌懸液中加入戊二醛，制得戊二醛質量濃度為5～15g/L的混合液，在10～15℃、30～60rpm條件下反應6～10h，經洗滌，制得交聯菌體；(2)取步驟(1)制得的交聯菌體配制菌體濃度為300～500g/L的交聯菌體懸液，然后與固定液按質量比0.8～1.2:1混合，將混合后的料液按1:2～5的質量比加入到質量百分比濃度為2～5％的氯化鈣溶液中，10～15℃硬化10～15h，固液分離，制得固定化細胞；所述固定液中含有質量百分比濃度為0.5～1.5％的PEG600和質量百分比濃度為3～5％的海藻酸鈉。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中的低聚果糖產生菌選自黑曲霉或米曲霉。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中菌懸液的菌體質量濃度為5～15g/L。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中低聚果糖產生菌的菌懸液，按如下方法制備：I、將菌株接種于活化培養基中，在溫度28～32℃的條件下活化培養66～78h，制得活化菌株；所述活化培養基為PDA培養基，組分如下：馬鈴薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、瓊脂15～20g、水1000mL，pH自然；馬鈴薯去皮后切成塊，煮沸30min，紗布過濾后加入糖及瓊脂，溶化后補水至1000mL，121℃滅菌30min。見沈萍等主編《微生物學實驗》第三版(高等教育出版社)215頁中的配制方法。II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養基中，在溫度28～32℃、攪拌轉速40～90rpm、通氣量0.5～2vvm的條件下培養18～24h，制得液體種子；所述種子培養基，組分如下，均為重量百分比：蔗糖4～7％、酵母膏3～5％、玉米粉1～3％，余量水，pH自然；III、將步驟II制得的液體種子按體積百分比8～12％的比例接種于發酵培養基中，在溫度28～32℃、攪拌轉速40～90rpm、通氣量0.5～2vvm的條件下發酵培養24～36h，固液分離，制得菌體；所述發酵培養基，組分如下，均為重量百分比：蔗糖7～10％、酵母膏2～4％、玉米粉0.5～1％，余量水，pH自然；IV、將步驟III制得的菌體與工業用無鹽水混合，配制成菌體濃度為5～15g/L的低聚果糖產生菌的菌懸液。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中的洗滌方法為：菌懸液過篩、重懸、再過篩，反復3～4次。上述制備方法制得的生產低聚果糖的固定化細胞。上述生產低聚果糖的固定化細胞在制備低聚果糖中的應用。上述應用，包括如下步驟：(a)將生產低聚果糖的固定化細胞填料至高徑比為3～6的反應柱中，向反應柱中泵入質量百分比濃度為45～55％的蔗糖溶液進行柱式循環反應，控制流量為4～6BV/h、溫度45～55℃、pH5.0～6.5，制得低聚果糖粗液；經檢測，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占總固形物質量百分比的56％以上；(b)將步驟(a)制得的低聚果糖粗液稀釋至質量濃度為30～35％，經離子交換脫鹽，濃縮，制得低聚果糖糖漿。根據本專利技術優選的，所述步驟(a)中，還包括每反應3～5天后向蔗糖溶液中補加氯化鈣至質量百分比濃度為0.3～0.5％，進行再硬化10～30h。本專利技術的設計原理專利技術人通過研究發現，生產菌種包埋前，通過特定濃度的戊二醛溶液在一定條件下進行交聯反應，可以增強胞內果糖基轉移酶的穩定性；同時，在固定化細胞制備過程中，通過添加聚乙二醇進行造孔，提高了固定化顆粒的傳質效率；此外，在固定化細胞使用過程中通過補加氯化鈣，可以保持固定化細胞顆粒的機械強度，減少由于固定化顆粒松軟而造成的菌體損失，從而制得固定化細胞酶活穩定性好、傳質效率高，連續使用3個月，酶活仍在70％以上的固定化細胞顆粒。有益效果1、本專利技術首次先采用戊二醛對細胞進行處理，然后用PEG600造孔和海藻酸鈣凝膠包埋，并在糖化過程中補充氯化鈣，最后獲得了酶活穩定性好、傳質效率高、連續使用3個月酶活仍高于70％的固定化細胞；2、本專利技術實現了產酶菌體的重復利用，減少了菌種培養的次數，降低了菌種培養過程中的能耗和原料消耗，從而降低生產成本；3、本專利技術在利用固定化細胞生產低聚果糖的過程中，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種生產低聚果糖的固定化細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)向低聚果糖產生菌的菌懸液中加入戊二醛，制得戊二醛質量濃度為5～15g/L的混合液，在10～15℃、30～60rpm條件下反應6～10h，經洗滌，制得交聯菌體；(2)取步驟(1)制得的交聯菌體配制菌體濃度為300～500g/L的交聯菌體懸液，然后與固定液按質量比0.8～1.2:1混合，將混合后的料液按1:2～5的質量比加入到質量百分比濃度為2～5％的氯化鈣溶液中，10～15℃硬化10～15h，固液分離，制得固定化細胞；所述固定液中含有質量百分比濃度為0.5～1.5％的PEG600和質量百分比濃度為3～5％的海藻酸鈉。

【技術特征摘要】
1.一種生產低聚果糖的固定化細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)向低聚果糖產生菌的菌懸液中加入戊二醛，制得戊二醛質量濃度為5～15g/L的混合液，在10～15℃、30～60rpm條件下反應6～10h，經洗滌，制得交聯菌體；(2)取步驟(1)制得的交聯菌體配制菌體濃度為300～500g/L的交聯菌體懸液，然后與固定液按質量比0.8～1.2:1混合，將混合后的料液按1:2～5的質量比加入到質量百分比濃度為2～5％的氯化鈣溶液中，10～15℃硬化10～15h，固液分離，制得固定化細胞；所述固定液中含有質量百分比濃度為0.5～1.5％的PEG600和質量百分比濃度為3～5％的海藻酸鈉。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的低聚果糖產生菌選自黑曲霉或米曲霉。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中菌懸液的菌體質量濃度為5～15g/L。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中低聚果糖產生菌的菌懸液，按如下方法制備：I、將菌株接種于活化培養基中，在溫度28～32℃的條件下活化培養66～78h，制得活化菌株；所述活化培養基為PDA培養基，組分如下：馬鈴薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、瓊脂15～20g、水1000mL，pH自然；馬鈴薯去皮后切成塊，煮沸30min，紗布過濾后加入糖及瓊脂，溶化后補水至1000mL，121℃滅菌30min。見沈萍等主編《微生物學實驗》第三版(高等教育出版社)215頁中的配制方法。II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養基中，在溫度28～32℃、攪拌轉速40～...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉宗利，李克文，欒慶民，王京博，劉克瑤，賈慧慧，胥九兵，
申請(專利權)人：保齡寶生物股份有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37