人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法，人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒包括：人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原包被的羧基化的磁微粒和人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。這種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒能夠以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測(cè)工具，完成人類免疫缺陷病毒抗原和（或）抗體的檢測(cè)。這種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，其抗原檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.25IU/mL，相對(duì)于傳統(tǒng)的人類免疫缺陷病毒抗原抗體的檢測(cè)方法，靈敏度至少提高了5倍，這種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)精度較高。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及體外檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
技術(shù)介紹
人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV）是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。普遍認(rèn)為，人類免疫缺陷病毒的感染導(dǎo)致艾滋?。ˋIDS，AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，后天免疫缺乏綜合癥），艾滋病是后天性細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)缺陷而導(dǎo)致嚴(yán)重隨機(jī)感染及/或繼發(fā)腫瘤并致命的一種疾病。艾滋病自1981年在美國(guó)被識(shí)別并發(fā)展為全球大流行，至2003年底，已累計(jì)導(dǎo)致兩千余萬(wàn)人死亡。HIV病毒呈球形或卵圓形顆粒，直徑100-140nm，是帶有包膜的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，在分類上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的慢病毒亞科。HIV病毒單拷貝基因組RNA長(zhǎng)約9.2-9.7Kb。目前發(fā)現(xiàn)有HIV-1和HIV-2兩型，這兩種類型在生物學(xué)特性上很相似，它們的基因組有40%-50%的同源性，其中兩種病毒的核心蛋白具有高度的交叉反應(yīng)。HIV有三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)基因：env、gag、pol，他們分別編碼產(chǎn)生不同功能的蛋白質(zhì)即抗原，抗原會(huì)引起機(jī)體免疫應(yīng)答從而產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。根據(jù)HIV基因差異，分為HIV-1和HIV-2，兩型間氨基酸序列的同源性為40%~60%。HIV-1可進(jìn)一步分為不同的亞型，包括M亞型組、O亞型組和N亞型組。目前全球流行的主要是HIV-1，不同地區(qū)流行的HIV-1亞型存在差異，在美國(guó)和西歐流行的主要是B亞型，我國(guó)以HIV-1為主要流行株，已發(fā)現(xiàn)的有A、B、B′、C、D、E、F和G共8個(gè)亞型，還有不同流行重組型。HIV-2主要在西非數(shù)國(guó)流行。近幾年，在歐洲和少數(shù)亞洲國(guó)家也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)少數(shù)HIV-2病例。1999年起在我國(guó)部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)少數(shù)HIV-2型感染者。當(dāng)HIV進(jìn)入人體進(jìn)行感染時(shí)，人體的免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)HIV的多種病毒蛋白產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。通常感染HIV后5-12周，可在血清中發(fā)現(xiàn)HIV感染的抗體。由于免疫抗原決定簇的抗原決定基序列不同，特別是HIV-1/M型，HIV-1/O型和HIV-2的膜蛋白不同，因此需要特異性抗原以確保免疫分析法能夠成功檢測(cè)HIV感染。通過(guò)測(cè)定近期感染患者（高病毒量）血標(biāo)本中HIV-1p24抗原，能夠較傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)法提早6天以上發(fā)現(xiàn)HIV感染。HIV免疫學(xué)檢測(cè)經(jīng)歷了幾代的發(fā)展歷程，目前最先進(jìn)的第4代HIV抗原抗體檢測(cè)試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)抗HIV-1/2抗體和p24抗原，縮短了診斷窗口期。臨床檢測(cè)人類免疫缺陷病毒抗原抗體的常見(jiàn)方法有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫金標(biāo)法、酶促化學(xué)發(fā)光法，但這些方法都存在著一些不足之處。一、酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）被廣泛應(yīng)用，但該方法也存在著下述的不足之處：（1）使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原或抗體包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無(wú)法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測(cè)；（2）檢測(cè)所用的試劑種類較多，每一種檢測(cè)試劑都要用試劑瓶來(lái)盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來(lái)分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；（3）缺少對(duì)檢測(cè)信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過(guò)查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識(shí)才能了解或知悉檢測(cè)試劑的生產(chǎn)批號(hào)及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測(cè)過(guò)程中不受控，具有很大的隨意性；（4）檢測(cè)試劑在檢測(cè)過(guò)程中處于開(kāi)放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；（5）檢測(cè)過(guò)程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過(guò)程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；（6）在檢測(cè)項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測(cè)10個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測(cè)10個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。二、免疫金標(biāo)法膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與抗原、抗體的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)；該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便快速，但靈敏度較低。三、化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光法按發(fā)光原理可分為直接化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光。酶促化學(xué)發(fā)光主要有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局限性，辣根過(guò)氧化物酶主要缺點(diǎn)為：魯米諾在沒(méi)有辣根過(guò)氧化物酶存在情況下，也會(huì)被H2O2氧化自身發(fā)光，本底相對(duì)較高，影響信噪比，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)復(fù)雜，影響因素多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，要得到靈敏度高且平臺(tái)期長(zhǎng)的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點(diǎn)為：底物達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間長(zhǎng)，底物成本高，導(dǎo)致檢測(cè)成本高，患者負(fù)擔(dān)重。吖啶酯作為標(biāo)記物的直接化學(xué)發(fā)光相比酶促化學(xué)發(fā)光具有明細(xì)優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在：反應(yīng)不需要催化劑，只要堿性環(huán)境即可進(jìn)行，反應(yīng)迅速，背景發(fā)光低，信噪比高，干擾因素少，試劑穩(wěn)定性好，可以兩點(diǎn)定標(biāo)，體系簡(jiǎn)單，激發(fā)液成本低，吖啶酯易與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
基于此，有必要提供一種檢測(cè)靈敏度較高的人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法。一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包括：人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原包被的羧基化的磁微粒和人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原包被的羧基化的磁微粒中，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原與所述羧基化的磁微粒的比例為1：25~100。在一個(gè)實(shí)施例中，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原與所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為1:10~100。在一個(gè)實(shí)施例中，所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。在一個(gè)實(shí)施例中，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。在一個(gè)實(shí)施例中，還包括化學(xué)發(fā)光底物液，所述化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。在一個(gè)實(shí)施例中，所述A液為H2O2溶液，所述B液為NaOH溶液。在一個(gè)實(shí)施例中，還包括人類免疫缺陷病毒化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒定標(biāo)品。在一個(gè)實(shí)施例中，所述人類免疫缺陷病毒抗原抗體定標(biāo)品為COI分別為0~0.5、1~20的血清或血漿。一種上述的人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟：取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入人類免疫缺陷病毒單克隆抗體或人類免疫缺陷病毒抗原，室溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到人類免疫缺陷病毒單克隆抗體或人類免疫缺陷病毒抗原包被的羧基化的磁本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原包被的羧基化的磁微粒和人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原包被的羧基化的磁微粒和人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原包被的羧基化的磁微粒中，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體、人類免疫缺陷病毒抗原與所述羧基化的磁微粒的比例為1：25~100。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，所述人類免疫缺陷病毒單克隆抗體及人類免疫缺陷病毒抗原與所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為1：10~100。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗原抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括化學(xué)發(fā)光底物...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳海霞，唐曙明，夏福臻，錢純亙，黃濤，祝亮，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司，深圳市人民醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44