一種分子標(biāo)記微珠及基于該分子標(biāo)記微珠的高通量單細(xì)胞測序方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種分子標(biāo)記微珠及基于該分子標(biāo)記微珠的高通量單細(xì)胞測序方法。一種用于高通量單細(xì)胞測序的分子標(biāo)記微珠，包括微珠本體和偶聯(lián)的作為分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，所述寡核苷酸鏈包括：通用引物序列，作為PCR擴(kuò)增時(shí)的引物結(jié)合區(qū)域；多聚T尾，與mRNA的poly?A序列結(jié)合；分子標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)結(jié)合的mRNA；細(xì)胞標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)mRNA取自的細(xì)胞。本發(fā)明專利技術(shù)分子標(biāo)記微珠的分子標(biāo)記序列分為4個(gè)功能區(qū)，分別為通用引物序列、細(xì)胞標(biāo)簽序列、分子標(biāo)簽序列和多聚T尾，基于該分子標(biāo)記微珠的高通量單細(xì)胞測序方法能夠一次性獲得上萬個(gè)單細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄組信息，且整套實(shí)驗(yàn)成本低、時(shí)間短、通量高，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，特別是涉及一種分子標(biāo)記微珠及基于該分子標(biāo)記微珠的高通量單細(xì)胞測序方法。
技術(shù)介紹
傳統(tǒng)的流式細(xì)胞分析能快速對(duì)成千上萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)的定量分析。流式熒光分選是通過表面抗原或者熒光標(biāo)記對(duì)需要分選的大量細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，可以靈活的根據(jù)需要的參數(shù)分選出需要的細(xì)胞亞群。經(jīng)過改造的流式熒光分選系統(tǒng)，將細(xì)胞密度稀釋控制的話還能完成單細(xì)胞分析。不過流式儀器的儀器，各類抗原成本較高，功能雖然強(qiáng)大，但主要還是進(jìn)行大量細(xì)胞定量分群分析。某些珍貴的樣品則很難達(dá)到流式分析細(xì)胞數(shù)量要求，比如早期的胚胎干細(xì)胞，來自病人腫瘤組織的樣本或特殊的血樣，細(xì)胞數(shù)目可能并沒有那么多，單細(xì)胞測序分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)思路也逐步為人們接受，擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組，基因組的方法逐漸成熟。進(jìn)行單細(xì)胞測序更加方便，另一方面，細(xì)胞間的異質(zhì)性表明每一個(gè)細(xì)胞都是完全不相同的，包括干細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞等等，不同組織中干細(xì)胞類群的定義也不明晰，比如造血系統(tǒng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。異質(zhì)性在這些組織中是相當(dāng)明顯但并未被完全解釋的。沒有兩個(gè)細(xì)胞的基因組，轉(zhuǎn)錄組水平上市完全類似的，因此對(duì)大量細(xì)胞的平均組學(xué)表達(dá)分析會(huì)平均掉本來在單個(gè)細(xì)胞中相當(dāng)顯著的表達(dá)特征，相應(yīng)的，大量細(xì)胞的群體分析很有可能是我們喪失了發(fā)現(xiàn)一些罕見的細(xì)胞亞群的機(jī)會(huì)，因此單細(xì)胞測序這一工具在胚胎，腫瘤，各類干細(xì)胞研究中都具有無法比擬的優(yōu)勢。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的不斷突破和測序儀器的廣泛使用，使單細(xì)胞測序分析越來越多的應(yīng)用到各類前沿生物醫(yī)學(xué)研究中。以往進(jìn)行的傳統(tǒng)單細(xì)胞測序分析是靠手工挑取單細(xì)胞，受限于人力分析的細(xì)胞數(shù)量是有限的，提高分析的細(xì)胞數(shù)量就能從大量數(shù)據(jù)中發(fā)掘更多有效信息，目前國內(nèi)尚無通量較高的單細(xì)胞測序分析平臺(tái)與相關(guān)技術(shù)，而國外2015年發(fā)表文章提到用微孔板分離細(xì)胞PCR后檢測少量基因表達(dá)，使用這個(gè)技術(shù)僅能同時(shí)檢測81個(gè)基因的表達(dá)情況，通量極低，并且成本高，應(yīng)用不廣。國外有基于微流控技術(shù)，使用微流體制造的連續(xù)不斷的液滴在微通道中包裹單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離，能達(dá)到較高的通量，同時(shí)使用帶有標(biāo)記的微珠結(jié)合單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的mRNA加以標(biāo)記，代表性的有哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院發(fā)表在《Cell》期刊中的Drop-seq與InDrop技術(shù)，兩者均是基于微流體技術(shù)的單細(xì)胞分離方法，能達(dá)到比較高的通量。除此以外，其他手工挑取，機(jī)器與流式技術(shù)改造的單細(xì)胞分選都達(dá)不到高通量單細(xì)胞測序分析的要求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了一種分子標(biāo)記微珠及基于該分子標(biāo)記微珠的高通量單細(xì)胞測序方法，該高通量單細(xì)胞測序方法能夠一次性獲得上萬個(gè)單細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄組信息。一種用于高通量單細(xì)胞測序的分子標(biāo)記微珠，包括微珠本體和偶聯(lián)的作為分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，其特征在于，所述寡核苷酸鏈包括：通用引物序列，作為PCR擴(kuò)增時(shí)的引物結(jié)合區(qū)域；多聚T尾，與mRNA的polyA序列結(jié)合；分子標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)結(jié)合的mRNA；細(xì)胞標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)mRNA取自的細(xì)胞。每個(gè)分子標(biāo)記微珠上均結(jié)合有大量的作為分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈。優(yōu)選的，所述微珠本體為磁珠。一般如果是普通的微珠而不是磁珠的話，在純化和洗滌時(shí)，需要通過重力方式來對(duì)分子標(biāo)記微珠進(jìn)行分離，比如自然沉降或者離心。而使用磁珠的話，可以直接使用磁力架進(jìn)行分離，比較方便，且速度更快。優(yōu)選的，所述微珠本體的直徑為15～25μm。使用時(shí)，需要一個(gè)微珠與一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，所以微珠的大小與所檢測的細(xì)胞大小接近為宜。優(yōu)選的，所述微珠與分子標(biāo)記偶聯(lián)方式為：分子標(biāo)記5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羥基，微珠表面修飾有羧基，羧基與所述胺基縮合。由于分子標(biāo)記為單鏈寡核苷酸，其5’端的第一個(gè)核苷酸上的羥基用胺基取代，微珠表面修飾羧基，通過胺基與羧基的反應(yīng)，將分子標(biāo)記偶聯(lián)到微珠上。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)簽序列至少部分為隨機(jī)合成。優(yōu)選的，所述細(xì)胞標(biāo)簽序列由多個(gè)特異性片段串接組成，不同位置的特異性片段選自相同的或不同的特異性片段庫，所述細(xì)胞標(biāo)簽序列利用所述特異性片段的排列組合方式不同標(biāo)識(shí)細(xì)胞。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記微珠的制備方法，包括以下步驟：(1)合成通用引物序列，所述通用引物序列3’端連接細(xì)胞標(biāo)簽序列的其中一個(gè)特異性片段；(2)將通用引物序列與微珠本體偶聯(lián)，獲得偶聯(lián)物；(3)通過PCR延伸在偶聯(lián)物3’端串接細(xì)胞標(biāo)簽序列的其余特異性片段，組裝形成細(xì)胞標(biāo)簽序列；(4)在細(xì)胞標(biāo)簽序列3’端依次連接分子標(biāo)簽序列和多聚T尾。本專利技術(shù)又提供了一種高通量單細(xì)胞測序方法，所述步驟為：(1)將細(xì)胞加入到微孔板中，然后加入所述的分子標(biāo)記微珠，其中微孔板上的微孔直徑大小為剛好容納一個(gè)細(xì)胞和一個(gè)分子標(biāo)記微珠；(2)加入裂解液，孵育；(3)收集分子標(biāo)記微珠-mRNA復(fù)合物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，獲得帶有所述分子標(biāo)記的cDNA；(4)構(gòu)建測序文庫，進(jìn)行高通量測序。分子標(biāo)記微珠的細(xì)胞標(biāo)簽序列，單個(gè)分子標(biāo)記微珠上的所有分子標(biāo)記均具有相同細(xì)胞標(biāo)簽序列，而不同分子標(biāo)記微珠間的分子標(biāo)記的細(xì)胞標(biāo)簽序列均不同，所以可以在最后得到的測序數(shù)據(jù)中區(qū)分哪些序列是來自于同一個(gè)細(xì)胞，哪些序列來自于不同的細(xì)胞。分子標(biāo)簽序列，單個(gè)分子標(biāo)記微珠上的所有分子標(biāo)記均具有不同分子標(biāo)簽序列，分子標(biāo)簽序列只負(fù)責(zé)單個(gè)分子標(biāo)記微珠上的所有分子標(biāo)簽序列不同，而不管不同細(xì)胞之間的分子標(biāo)簽序列，合成時(shí)是由若干個(gè)隨機(jī)合成的核苷酸組成，對(duì)于單個(gè)細(xì)胞來說，可以使得每一條mRNA結(jié)合的分子標(biāo)簽序列可以由分子標(biāo)簽序列來區(qū)分，對(duì)于最后得到的測序數(shù)據(jù)來說，可以在用細(xì)胞標(biāo)簽序列區(qū)分了不同細(xì)胞后，再根據(jù)分子標(biāo)簽序列的差異區(qū)分哪些是真實(shí)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)差異造成的mRNA拷貝數(shù)存在差異，而哪些是由同一條mRNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增得來，由PCR擴(kuò)增造成的拷貝數(shù)差異需要在數(shù)據(jù)處理時(shí)，進(jìn)行矯正。為了保證獲得單個(gè)的細(xì)胞，優(yōu)選的，細(xì)胞加入微孔板中的落孔率控制在8％～12％。落孔率過大不利于獲得一個(gè)孔中只有一個(gè)細(xì)胞。而為了盡量使所有細(xì)胞都能夠結(jié)合一個(gè)分子標(biāo)記微珠，優(yōu)選的，分子標(biāo)記微珠加入微孔板中的落孔率大于99％。如果分子標(biāo)記微珠的落孔率太小，則容易造成部分細(xì)胞結(jié)合不到分子標(biāo)記微珠，相當(dāng)于最終結(jié)果中缺少部分細(xì)胞的數(shù)據(jù)，這樣不利于反映待檢測細(xì)胞整體的情況。優(yōu)選的，所述微孔板制備方法為：(1)在硅片上刻蝕出微孔作為初始模具，微孔直徑20～50μm；(2)在初始模具上澆注聚二甲基硅氧烷(PDMS)，成型后取下成為帶有微柱的反向模具；(3)在反向模具上澆注加熱融化的濃度為4％～6％的瓊脂糖，冷卻成型后，取下即為微孔板。本專利技術(shù)分子標(biāo)記微珠的分子標(biāo)記序列分為4個(gè)功能區(qū)，分別為通用引物序列、細(xì)胞標(biāo)簽序列、分子標(biāo)簽序列和多聚T尾，基于該分子標(biāo)記微珠的高通量單細(xì)胞測序方法能夠一次性獲得上萬個(gè)單細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄組信息，且整套實(shí)驗(yàn)成本低、時(shí)間短、通量高，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為微孔板示意圖；圖2為分子標(biāo)記磁珠制備流程圖；圖3為分子標(biāo)記微珠性能檢測結(jié)果圖，其中圖A為單個(gè)分子標(biāo)記微珠上分子標(biāo)記數(shù)檢測結(jié)果圖，圖B為分子標(biāo)記微珠均一性檢測結(jié)果圖，共檢測6個(gè)分子標(biāo)記微珠；圖4為分子標(biāo)記微珠結(jié)合mRNA能力檢測時(shí)的凝膠電泳圖；圖5為制備的cDNA測序文庫片段大小分布圖；圖6為實(shí)施例2中人鼠混合細(xì)胞分群對(duì)比圖；圖7為實(shí)施例3中CD34+細(xì)胞基因表達(dá)差異熱圖圖8為實(shí)施例3中CD34+細(xì)胞tSNE分本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于高通量單細(xì)胞測序的分子標(biāo)記微珠，包括微珠本體和偶聯(lián)的作為分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，其特征在于，所述寡核苷酸鏈包括：通用引物序列，作為PCR擴(kuò)增時(shí)的引物結(jié)合區(qū)域；多聚T尾，與mRNA的poly?A序列結(jié)合；分子標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)結(jié)合的mRNA；細(xì)胞標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)mRNA取自的細(xì)胞。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于高通量單細(xì)胞測序的分子標(biāo)記微珠，包括微珠本體和偶聯(lián)的作為分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，其特征在于，所述寡核苷酸鏈包括：通用引物序列，作為PCR擴(kuò)增時(shí)的引物結(jié)合區(qū)域；多聚T尾，與mRNA的polyA序列結(jié)合；分子標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)結(jié)合的mRNA；細(xì)胞標(biāo)簽序列，標(biāo)識(shí)mRNA取自的細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記微珠，其特征在于，所述微珠本體為磁珠。3.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記微珠，其特征在于，所述微珠本體的直徑為15～25μm。4.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記微珠，其特征在于，所述分子標(biāo)簽序列至少部分為隨機(jī)合成。5.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記微珠，其特征在于，所述細(xì)胞標(biāo)簽序列由多個(gè)特異性片段串接組成，不同位置的特異性片段選自相同的或不同的特異性片段庫，所述細(xì)胞標(biāo)簽序列利用所述特異性片段的排列組合方式不同標(biāo)識(shí)細(xì)胞。6.如權(quán)利要求5所述分子標(biāo)記微珠的制備方法，包括以下步驟：(1)合成通用引物序列，所述通用引物序列3’端連接細(xì)胞標(biāo)簽序列的其中一個(gè)特異性片段；(2)將通用引物序列與微珠本體偶聯(lián)，獲得偶聯(lián)物；(3)通過PCR延伸在...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郭國驥，賴淑靜，葉昉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33