一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測(cè)樣本中miRNA的方法及配套微流控裝置制造方法及圖紙

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測(cè)樣本中miRNA的方法及配套微流控裝置。富集并檢測(cè)miRNA方法包括以下步驟：（1）將抗Ago2單克隆抗體連接在磁珠上，得到抗Ago2免疫磁珠；（2）將抗Ago2免疫磁珠與樣品混合，通過抗原抗體免疫反應(yīng)富集Ago2?miRNA復(fù)合物；（3）利用裂解液將富集后的Ago2?miRNA復(fù)合物高溫變性，釋放出miRNA進(jìn)行后續(xù)定量分析。本發(fā)明專利技術(shù)集合抗原抗體免疫識(shí)別與結(jié)合的高特異性和高親和性磁珠分離的簡便易操作性以及微流控裝置的高效反應(yīng)和富集等特性，可快速檢測(cè)生物樣本如血液、尿液、唾液、關(guān)節(jié)滑液以及細(xì)胞裂解液等中與疾病特別是腫瘤相關(guān)的多種miRNA，對(duì)臨床上重大疾病的盡早發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確診斷等都具有重要的意義。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種富集并檢測(cè)生物樣本中miRNA的方法及配套微流控裝置，屬于樣本中微量或痕量microRNA高靈敏度檢測(cè)及腫瘤等重大疾病的早期快速診斷

技術(shù)介紹
MicroRNA(miRNA)是體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的一類非編碼RNA，在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤細(xì)胞和正常組織來源的細(xì)胞在miRNA表達(dá)譜上具有明顯差異，大約50%得到注解的miRNA的基因位于與腫瘤形成相關(guān)的脆弱基因位點(diǎn)，這說明miRNA在腫瘤的發(fā)生過程中具有十分重要的作用。因此，研究miRNA的種類及含量對(duì)我們研究腫瘤的診斷、分類和治療等都具有十分重要的意義。然而，miRNA的含量很少，僅占總RNA數(shù)量的一小部分（約0.01％），而且樣本在處理及提取過程中必然會(huì)損失一部分miRNA，同時(shí)miRNA容易降解，從而給準(zhǔn)確定量檢測(cè)miRNA帶來了較大的挑戰(zhàn)。鑒于miRNA易分解且含量較少，因而對(duì)miRNA的高效富集對(duì)miRNA的精確定量檢測(cè)就顯得尤其重要。目前市面上有多種RNA的抽提試劑盒，能夠抽提生物樣本內(nèi)的總RNA，而miRNA的富集提取方法也類似于抽提生物樣本的總RNA，但是試劑盒采用的方法常側(cè)重于保留小RNA。近年來研究的通過富集miRNA-蛋白復(fù)合物來提取miRNA不失為一種新型方法。Ago2蛋白是Argonaute蛋白家族的一種，是Argonaute蛋白在進(jìn)化過程中演變成的一種亞科蛋白，另外幾種亞科蛋白為Ago1、Ago3和Ago4。4種Argonaute蛋白可以分別識(shí)別不同的小RNA分子并組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），但目前只有Ago2-miRNA復(fù)合物被證明具有對(duì)靶標(biāo)RNA裂解的切割酶活性。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA不止存在于細(xì)胞質(zhì)中，完整的miRNA也可以進(jìn)入血液和組織液的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)。2011年Jason和其組員發(fā)現(xiàn)，血漿中的miRNA多數(shù)是與某種蛋白形成復(fù)合物而穩(wěn)定存在，并非如最初所猜測(cè)的以囊泡包裹的形式存在。通過進(jìn)一步研究，他們確定這種與miRNA結(jié)合的蛋白就是Argonaute蛋白家族中的Ago2蛋白。并且他們發(fā)現(xiàn)用Ago2共沉淀下來的miRNA占血漿總miRNA的大多數(shù)，只有很少量的miRNA是被囊泡包裹而存在的。這個(gè)結(jié)果說明循環(huán)miRNA可以以兩種形式存在，而Ago2-miRNA復(fù)合物形式是血漿中miRNA穩(wěn)定存在的主要原因。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的提供一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集和檢測(cè)樣本中與Ago2結(jié)合的miRNA的方法及配套微流控裝置。本專利技術(shù)的具體技術(shù)方案是：一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集生物樣本中miRNA的方法，富集方法包括以下步驟：（1）將抗Ago2抗體與磁珠連接，得到抗Ago2免疫磁珠。（2）將抗Ago2免疫磁珠與樣品混合，通過抗原抗體免疫反應(yīng)富集Ago2-miRNA復(fù)合物。進(jìn)一步的，所述磁珠為具有蛋白親和力的磁珠。進(jìn)一步的，所述抗Ago2抗體為抗Ago2的單克隆抗體或抗Ago2的多克隆抗體。進(jìn)一步的，所述步驟（1）所述抗Ago2免疫磁珠制備方式如下：取所需用量的磁珠，除去原保存溶液；加入PBS緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液；加入抗Ago2抗體及PBS緩沖液，常溫混合孵育一定時(shí)間，除去剩余抗體溶液；加入PBST緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液，重懸所得抗Ago2免疫磁珠并換入新管。所述步驟（2）所述免疫磁珠富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物方法如下：將步驟（1）所得抗Ago2免疫磁珠與樣本混合孵育一定時(shí)間；加入PBST緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液，重懸磁珠并換入新管。本專利技術(shù)還提供了一種基于磁珠偶聯(lián)抗體檢測(cè)樣本中miRNA的方法，檢測(cè)方法包括以下步驟：（1）將根據(jù)權(quán)利要求1富集到Ago2-miRNA的免疫磁珠與適量裂解液混合，高溫反應(yīng)一定時(shí)間，除去磁珠。（2）反應(yīng)完成后將所得的液體進(jìn)行qPCR檢測(cè)。本專利技術(shù)還提供了一種富集樣本中miRNA的微流控裝置，所述微流控裝置制備包括以下步驟：（1）根據(jù)上述磁珠免疫富集方法設(shè)計(jì)制備微流控芯片模板；（2）在微流控芯片模板上澆注PDMS聚合物經(jīng)固化得到PDMS膜；（3）將PDMS膜與玻璃片進(jìn)行等離子鍵合，封裝得到所需微流控芯片裝置。上述生物樣本包括血液、尿液、唾液、關(guān)節(jié)滑液或細(xì)胞裂解液等。本專利技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于，集合抗原抗體免疫識(shí)別與結(jié)合的高特異性和高親和性磁珠分離的簡便易操作性以及微流控裝置的高效反應(yīng)和富集等特性，可快速檢測(cè)生物樣本如血液、尿液、唾液、關(guān)節(jié)滑液以及細(xì)胞裂解液等中與疾病特別是腫瘤相關(guān)的多種miRNA，對(duì)癌癥等重大疾病的及早發(fā)現(xiàn)和診斷治療等具有重要意義。附圖說明圖1為富集血清中Ago2-miRNA復(fù)合物的WesternBlot驗(yàn)證結(jié)果。圖2為磁珠富集并qPCR檢測(cè)血清中與Ago2結(jié)合miRNA結(jié)果。圖3為微流控裝置設(shè)計(jì)方案及實(shí)物圖。圖4為微流控富集系統(tǒng)。圖5為微流控系統(tǒng)富集并qPCR檢測(cè)血清中與Ago2結(jié)合的miRNA結(jié)果。具體實(shí)施方式本專利技術(shù)一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測(cè)樣本中miRNA的方法，包括以下步驟：（1）取適量ProteinG磁珠，除去原保存溶液，使用PBS緩沖液清洗兩次，除去清洗溶液；（2）使用PBS緩沖液重懸磁珠，并加入適量抗Ago2單克隆抗體，常溫孵育一定時(shí)間；（3）在離心管進(jìn)行富集反應(yīng)時(shí)，使用PBST緩沖液清洗兩次，除去多余抗體，并重懸免疫磁珠移入新的離心管；（4）將免疫磁珠與待測(cè)樣本混合，常溫孵育一定時(shí)間；（5）使用PBST緩沖液清洗兩次，除去洗液，并重懸免疫磁珠移入新的離心管；（6）收集反應(yīng)后的免疫磁珠，取少量進(jìn)行洗脫，將洗脫液通過WesternBlot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否富集到Ago2蛋白；余下磁珠經(jīng)DTT裂解得到miRNA并進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定量分析；（7）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算裂解液中miRNA的含量，并根據(jù)富集樣本的體積以及裂解液的體積計(jì)算得到樣本中miRNA含量。（8）在利用微流控裝置進(jìn)行富集反應(yīng)時(shí)，結(jié)合分離富集方法，設(shè)計(jì)制備微流控芯片模板；（9）在微流控芯片模板上澆注PDMS聚合物經(jīng)固化得到PDMS膜；（10）將PDMS膜與玻璃片進(jìn)行等離子鍵合，封裝得到所需微流控芯片裝置。（11）使用PBST緩沖液清洗通道，再使用PBS緩沖液清洗通道，通入封閉液封閉微流控通道表面的活性區(qū)域；（12）將與Ago2蛋白結(jié)合的免疫磁珠導(dǎo)入已經(jīng)使用BSA溶液封閉后的微流控孔道，使用磁鐵將磁珠固定于孔道內(nèi)部；（13）導(dǎo)入待測(cè)樣本，使免疫磁珠與樣本混合孵育一定時(shí)間；（14）使用PBST緩沖液清洗孔道，再使用PBS緩沖液清洗通道；（15）除去磁鐵，收集免疫磁珠，并使用裂解液進(jìn)行裂解得到miRNA溶液，后進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)；（16）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算裂解液中miRNA的含量，并根據(jù)富集樣本體積以及裂解液體積計(jì)算得到樣本中miRNA含量。以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本專利技術(shù)的內(nèi)容，但不為本專利技術(shù)的限制。在不背離本專利技術(shù)實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本專利技術(shù)步驟或條件有所修改，均屬于本專利技術(shù)的范圍。實(shí)施例中所用試劑和儀器：抗Ago2小鼠單克隆抗體（ab57113，Abcam，美國）；抗Ago2兔單克隆抗體（ab186733，Abcam，美國）；ProteinG磁珠（Invitrogen公司，美國）；Ago2蛋白（北京義翹神州，中國）；有機(jī)灌封膠（道康寧，美國），其余試劑均為本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測(cè)樣本中miRNA的方法及配套微流控裝置，具體包括一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測(cè)樣本中miRNA的方法和與此方法配套的微流控裝置。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測(cè)樣本中miRNA的方法及配套微流控裝置，具體包括一種基于磁珠偶聯(lián)抗體富集并檢測(cè)樣本中miRNA的方法和與此方法配套的微流控裝置。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁珠偶聯(lián)抗體富集樣本中miRNA的方法，其特征在于，富集方法包括以下步驟：（1）將抗Ago2抗體與磁珠連接，得到抗Ago2免疫磁珠；（2）將抗Ago2免疫磁珠與樣品混合，通過抗原抗體免疫反應(yīng)富集Ago2-miRNA復(fù)合物。3.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的富集方法，其特征在于，所述磁珠為具有蛋白親和力的磁珠。4.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的富集方法，其特征在于，所述抗Ago2抗體為抗Ago2蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的富集方法，其特征在于，步驟（1）所述抗Ago2免疫磁珠制備方式如下：取適量的蛋白磁珠；利用PBS緩沖液清洗兩次；加入抗Ago2單克隆抗體及PBS緩沖液，常溫混合并孵育一定時(shí)間，除去剩余抗體溶液；加入PBST緩沖液清洗兩次；重懸所得抗Ago2免疫...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葉邦策，吳姍，左鵬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華東理工大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31