一株短短芽孢桿菌菌株及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一株短短芽孢桿菌菌株Brevibacillus?brevis?A1，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?NO.11148；本發明專利技術涉及的Brevibacillus?brevis?A1菌株能以羽毛粉作為唯一碳氮源，將菌株接入有完整羽毛的發酵培養基中，發酵培養48h后，羽毛、羽枝絕大部分被降解，降解羽毛角蛋白效果顯著；該菌株所產角蛋白酶最適作用溫度為55-60℃，為中溫中性角蛋白酶，最適pH為7.0，可應用于羽毛降解的相關生產領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物
，具體涉及一株短短芽孢桿菌菌株及其在降解角蛋白中的應用。
技術介紹
人們生活的環境中存在著大量的廢棄羽毛，每年有數以百萬計的羽毛得不到合理的利用。羽毛中含有豐富的角蛋白，若加以合理的利用，可使得角蛋白轉化為能被利用的可溶性蛋白。但是由于其中的二硫鍵、氫鍵等高度交聯，常見的水解酶像胃蛋白酶、胰蛋白酶等難以降解。傳統物理降解法原理是利用特殊溫度、壓力條件使羽毛水解為可溶性多肽或寡肽混合物，高壓蒸汽可增加角蛋白的溶解性。該法工藝流程簡單，將羽毛除雜、投入反應器后通入蒸汽，得到塊狀蛋白產物后烘干粉碎便可作為動物飼料。但是此方法多會破壞氨基酸分子鍵，產物穩定性差，若作為動物飼料，得到的蛋白粉口味較差，消化率低，限制了物理法的應用范圍。化學降解法利用酸、堿或氧化還原劑使羽毛中的角蛋白降解為可溶性蛋白、多肽或游離氨基酸。Kelly等利用Ca(OH)2處理雞羽毛生產動物飼料，反應溫度在150℃，羽毛角蛋白25min內溶解80%，反應后經碳酸化可回收54%的鈣劑。利用NaOH的堿水解法可產生多種不同肽鏈，增加酰胺鍵和亞砜含量能改變角蛋白的化學性質，堿溶液在65℃反應，2～5h內可提出68%～82%的水溶性角蛋白，富含中間纖維和中間纖維絲成分，若將NaOH與Na2S聯合溶解羽毛，40℃便能提取出角蛋白。氧化還原劑的使用也可降解羽毛，水、甘油和亞硫酸鈉的組合可降解羽毛產生液體角蛋白，而巰基乙酸等物質的預處理可有效破壞二硫鍵。Schrooyen等選用2-巰基乙醇和尿素共同降解雞羽毛，尿素起蛋白質溶脹作用，采用滲析除去巰基乙醇和尿素后發現，角蛋白多肽出現聚集現象，并且半胱氨酸殘留物氧化形成凝膠，影響了角蛋白溶液的穩定性。改變實驗條件發現在滲析前加入十二烷基硫酸鈉（SDS）可阻止多肽鏈的聚集。但堿法效率不高，產物主要為多肽；酸法會腐蝕設備、污染環境，且復合氨基酸產率不高。微生物途徑來解決角蛋白難以降解這個問題一直以來都廣受關注，早在十九世紀初，就發現一些生物能夠分解角蛋白。迄今為止包裹細菌、真菌、放線菌等超過30幾種微生物能降解角蛋白。隨著分子生物學技術的發展，對角蛋白酶的研究重新成為熱點。微生物降解法效果顯著，即利用了蛋白資源，也有利于環境保護。因此微生物角蛋白酶降解法可使羽毛粉的營養價值顯著提高，所獲得經濟效益顯然要比普通的加工方法高得多。目前已經篩選和分離到很多能降解角蛋白的細菌，主要為芽孢桿菌。其他芽孢桿菌包括蘇云金芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。傅偉等人研究的蘇云金芽孢桿菌和王政等人研究的地衣芽孢桿菌在分別發酵3d和5d后降解率分別是72.5%、84.06%。但是發酵時間過長本專利技術所提供的菌株在發酵兩天后羽毛的降解率即可達61.5%，大大縮減了發酵時間。
技術實現思路
本專利技術的目的提供一株產角蛋白酶的短短芽孢桿菌菌株BrevibacillusbrevisA1，其在2015年7月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.11148，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。本專利技術中所述的短短芽孢桿菌菌株BrevibacillusbrevisA1具有以下微生物學特征：本菌株分離所用的培養基為羽毛粉培養基，培養基各組分為磷酸二氫鉀1.5g、七水硫酸鎂0.025g、氯化鈣0.025g、七水硫酸亞鐵0.015g、羽毛粉10g、2%的瓊脂粉，蒸餾水1000mL。基礎培養基為LB培養基，培養基成分為：NaCl10.0g、酵母粉5.0g、蛋白胨10.0g、水1000mL。1、形態學特征菌落特征為邊緣平整、菌體濕潤、表面光滑、半透明、形狀較規則、顏色為淡黃色。2、生理生化特征菌株BrevibacillusbrevisA1為革蘭氏陽性菌，最適生長溫度為37℃左右，在低于20℃和高于50℃都不生長；在7%的NaCl濃度中不生長，H2S反應顯陽性，厭氧生長，最適pH7。3、本專利技術中短短芽孢桿菌A1碳源利用情況，使用杭州微生物試劑有限公司的腸桿菌科細菌生化鑒定管所得出；通過挑取單菌落穿刺至培養基中部，在37℃培養24h左右，通過培養基顏色的變化判斷是陰性還是陽性，注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。。本專利技術提供的BrevibacillusbrevisA1與相似度最高菌株短短芽孢桿菌NBRC100599的表型特征比較結果見下表：BrevibacillusbrevisA1與短短芽孢桿菌NBRC100599（Genbank:HQ585418.1）的特征比較注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“V”表示可變。本專利技術是通過以下技術方案實現的：①采集羽毛堆積場所的羽毛，取適量的羽毛放入裝有無菌水的三角瓶中，震蕩混勻，靜置十分鐘吸取上清液1mL進行梯度稀釋至10-7，每個梯度都取100μL涂布于初篩培養基平板上；在37℃條件下培養72h，挑取平板長出的菌落；②將得到的單菌落分別接種到復篩培養基，37℃震蕩培養，48h后觀察羽毛降解情況，并測定其中可溶性蛋白含量及羽毛的降解率，優選一株高效降解菌株；③菌株的16SrDNA鑒定提取菌株的總DNA，用細菌16SrDNA通用引物擴增目的片段，對片段進行回收、克隆、測序。對細菌16SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST進行16SrDNA的相似性比對，結果顯示與BrevibacillusbrevisNBRC100599的同源性99%，初步認定它是短短芽孢桿菌，命名為A1。所述初篩培養基的成分為：磷酸二氫鉀1.5g，七水硫酸鎂0.025g，氯化鈣0.025g，七水硫酸亞鐵0.015g，羽毛粉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。復篩培養基：不加瓊脂的初篩培養基，以適量的羽毛代替羽毛粉。本專利技術的優點和技術效果是：1、本專利技術菌株BrevibacillusbrevisA1菌株能降解羽毛或羽毛粉；2、本專利技術菌株BrevibacillusbrevisA1菌株不僅能在以羽毛為唯一的碳氮源的發酵培養基里生長，發酵24h后可見羽枝有明顯脫落，48h羽枝完全脫落，且其中大部分被降解，脫毛及降解角蛋白效果顯著。附圖說明圖1為BrevibacillusbrevisA1菌株對羽毛降解效果圖，其中A圖是羽毛降解前，B圖是羽毛降解48h后。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本專利技術的保護范圍。實施例1：短短芽孢桿菌菌株Br本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種短短芽孢桿菌菌株Brevibacillus?brevis?A1，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?NO.11148。

【技術特征摘要】
1.一種短短芽孢桿菌菌株BrevibacillusbrevisA1，其在中國微生物菌種保藏管理
委員會普通微生物...

【專利技術屬性】
技術研發人員：林連兵，周少威，鄧先余，魏云林，張琦，季秀玲，
申請(專利權)人：昆明理工大學，
類型：發明
國別省市：云南;53