丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術涉及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測試劑盒，屬于臨床體外診斷試劑技術領域。本發明專利技術的目的是能夠提供有效消除內源性α?酮戊二酸干擾且穩定性良好的丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒，使測定丙氨酸氨基轉移酶的結果更加準確可靠。本發明專利技術的試劑盒包括試劑1和試劑2：其中試劑1的組分包括：Tris?HCl緩沖液、L?丙氨酸、還原型輔酶(NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)、酶保護劑、穩定劑、防腐劑；試劑2的組分包括：Tris?HCl緩沖液、α?酮戊二酸、穩定劑、防腐劑。本發明專利技術所提供的ALT檢測試劑盒加入酶保護劑、穩定劑，提高了丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒的穩定性，適用于各類全自動生化分析儀，操作簡單、安全，便于臨床應用推廣。

【技術實現步驟摘要】

：本專利技術屬于臨床體外診斷試劑
，涉及丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒。
技術介紹
：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)是能夠催化丙氨酸與α-酮戊二酸之間的氨基轉移酶，是一種參與人體蛋白質新陳代謝的酶，起著加快人體內蛋白質在體內轉化的作用，該酶廣泛存在于人體各種組織、器官、肌肉、骨骼中，以肝臟細胞的細胞漿中最多。一旦有肝細胞遭到損害、肝功能下降、肝細胞壞死，細胞內的ALT即可釋放到細胞外，從而導致血清中ALT含量升高。ALT活性升高表示有肝細胞損傷，也可見于心肌及骨骼肌損傷。血清ALT活性是肝細胞損傷的敏感指標，尤其是病毒性肝炎的重要標志，目前ALT臨床上主要用來檢測肝功能。體外檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的方法主要有賴氏比色法、丙酮酸氧化酶法及連續監測法(速率法)。賴氏比色法的缺點是易受反應產物丙酮酸的反饋抑制影響，導致測定結果的準確度和精密度不高；丙酮酸氧化酶法雖然測定結果較好，但所用的4-氨基安替比林有毒、有致畸性，不滿足綠色原則；連續監測法的優點是可以確定線性期并計算每分鐘吸光度的變化(ΔA/min)，根據此值再準確地計算酶活性，可以利用全自動生化分析儀進行檢測；酶和底物反應的特異性好，檢測結果準確度高。以上三種方法相比較，采用連續監測法較佳。本專利技術的試劑盒主要采用連續監測法進行檢測，其檢測原理為：ALT催化L-丙氨酸的氨基轉移至α-酮戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸。乳酸脫氫酶(LDH)催化丙酮酸還原的同時將還原型輔酶(NADH)氧化成氧化型輔酶(NAD+)，由于NADH在340nm處有特征吸收，所以NADH的下降速率和ALT的活力成正比。反應式如下：目前ALT檢測試劑盒多采用丙酮酸氧化酶法，如CN103320497B(2015.09.09)、CN100595282C(2010.03.24)、CN1086205C(2002.06.12)均采用此法；CN104195220A(2014.12.10)主要講到緩沖液對ALT試劑的影響；CN104404127A(2015.03.11)所述ALT試劑盒采用單一試劑，無法消除內源性干擾。本專利技術涉及的丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒采用液體雙試劑，可以有效消除內源性干擾，無需樣本前處理，可直接利用全自動生化分析儀進行大批量樣本檢測，操作簡單、準確度高、穩定性好，適合臨床應用推廣。
技術實現思路
：本專利技術的目的在于提供丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒供臨床應用，主要解決現有ALT檢測領域存在的準確度低、操作繁瑣、污染環境、試劑不穩定等問題。為了解決本專利技術內源性α-酮戊二酸對丙氨酸(ALT)測定的干擾，采用如下技術方案：采用兩步法檢測，血清與(缺少α-酮戊二酸)的底物溶液混合，37℃保溫5min，使樣品中所含內源性α-酮戊二酸引起的副反應進行完畢。然后加入α-酮戊二酸啟動ALT的催化反應，在主波長340nm處連續監測吸光度下降速率，根據線性反應期吸光度下降速率(-ΔA/min)，計算出ALT活力。本專利技術提供的試劑盒由試劑1和試劑2組成，其中試劑1的組成和成份如下：Tris-HCl緩沖液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸650mmol/L-850mmol/L還原型輔酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L乳酸脫氫酶(LDH)2000U/L-3000U/L酶保護劑穩定劑防腐劑試劑2的組成和成份如下：Tris-HCl緩沖液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸35mmol/L-55mmol/L穩定劑防腐劑所述酶保護劑選自牛血清白蛋白(BSA)或甘油與糖類中的一種或多種組合物，其用量為BSA0.1％-2％，甘油5％-20％，優選為BSA0.5％-1.5％，甘油10％-15％。以上所述糖類可選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖中的一種或多種，其用量為1g/L-15g/L，優選為5g/L-10g/L。所述試劑1和試劑2的穩定劑均選自KCl及表面活性劑組合物，其用量為KCl1g/L-15g/L，優選為5g/L-10g/L。以上所述表面活性劑可選自吐溫-20(Tween-20)、吐溫-80(Tween-80)、曲拉通X-100(TritonX-100)、聚乙二醇6000(PEG6000)及聚乙二醇8000(PEG8000)中的一種或多種，其用量為0.1％-2％，優選為0.5％-1.5％。所述試劑1和試劑2的防腐劑均可選自NaN3或Proclin-300，其用量為NaN30.1g/L-2g/L，Proclin-3000.1％-2％，優選為NaN30.6g/L-1g/L，Proclin-3000.5％-1％。本專利技術丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測試劑盒適用于各類全自動生化分析儀，現于全自動生化分析儀BS-420上的應用，其具體使用方法如下：表1樣本檢測操作程序計算方法：樣品中的ALT含量(U/L)＝ΔAT/min×FΔAT/min：測定管平均每分鐘相對空白管吸光度變化注：TV：試劑樣品總體積，SV為樣品體積；6.22：NADH在340nm處的毫摩爾分子吸光系數；1.0：比色皿光徑(cm)；1000：U/mL到U/L的轉換系數。本專利技術所使用的質控品為羅氏高、低值質控品；所測樣品為不溶血血清。有益效果：本專利技術丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒為液體雙試劑，采用兩步法，有效消除內源性α-酮戊二酸干擾，提高了ALT測定的準確度；本專利技術試劑盒中加入酶保護劑和穩定劑，提高了ALT試劑盒的穩定性，于37℃水浴可穩定至少一周，說明2-8℃保存可以至少穩定一年。以下結合具體實施例進一步說明本專利技術，應理解，具體實施方式僅用于說明本專利技術，而非限制本專利技術。附圖說明：圖1是本專利技術實施例1-3及對比實施例2-8℃保存一周的空白吸光度變化對比試驗結果圖；圖2是本專利技術實施例1-3及對比實施例37℃水浴一周的空白吸光度變化對比試驗結果圖。具體實施方式實施例1丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：試劑1的組成：Tris-HCl緩沖液120mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸650mmol/LNADH0.2mmol/LLDH2000U/LKCl5g/L曲拉通X-1001％甘油15％蔗糖5g/LNaN31g/L試劑2的組成：Tris-HCl緩沖液100mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸35mmol/LKCl6g/LPEG80001.5％NaN30.6g/L實施例2丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：試劑1的組成：Tris-HCl緩沖液150mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸750mmol/LNADH0.3mmol/LLDH2500U/LKCl8g/L吐溫-201％BSA1.5％麥芽糖10g/LProclin-3000.8％試劑2的組成：Tris-HCl緩沖液80mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸45mmol/LKCl8g/LPEG60001％Proclin-3000.5％實施例3丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：試劑1的組成：Tris-HCl緩沖液180mmol/L，P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，其特征在于，試劑1的組成和成份如下：Tris?HCl緩沖液120mmol/L?180mmol/L，PH＝8.4L?丙氨酸650mmol/L?850mmol/L還原型輔酶(NADH)0.2mmol/L?0.4mmol/L乳酸脫氫酶(LDH)2000U/L?3000U/L酶保護劑穩定劑防腐劑試劑2的組成和成份如下：Tris?HCl緩沖液60mmol/L?100mmol/L，PH＝7.2α?酮戊二酸35mmol/L?55mmol/L穩定劑防腐劑。

【技術特征摘要】
1.丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，其特征在于，試劑1的組成和成份如下：Tris-HCl緩沖液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.4L-丙氨酸650mmol/L-850mmol/L還原型輔酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L乳酸脫氫酶(LDH)2000U/L-3000U/L酶保護劑穩定劑防腐劑試劑2的組成和成份如下：Tris-HCl緩沖液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.2α-酮戊二酸35mmol/L-55mmol/L穩定劑防腐劑。2.如權利要求1所述的丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒，其特征在于，所述酶保護劑選自牛血清白蛋白(BSA)或甘油與糖類中的一種或多種組合物，其用量為BSA0.5％-1.5％，甘油10％-15％。3.如權利要求2所述的糖類，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王賢俊，張敏，
申請(專利權)人：王賢俊，
類型：發明
國別省市：浙江;33