一種檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態性的方法及其應用技術

本發明專利技術公開了一種檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態性的方法及其應用：以待測綿羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增綿羊KITLG基因片段；用限制性內切酶SspI消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑒定綿羊KITLG基因第47569的堿基多態性。由于該堿基突變位點與綿羊繁殖性狀產羔數密切關聯，所以該方法是一種在DNA水平上檢測與綿羊繁殖性狀密切相關分子遺傳標記的方法，可以用于綿羊的輔助選擇和分子育種，加快綿羊良種繁育速度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及以綿羊的功能基因的單核苷酸多態性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及綿羊KITLG基因的單核苷酸多態性及其檢測方法。
技術介紹
在動物育種中，人們期望通過對生長、繁殖等性狀密切相關，并且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。分子育種，即分子標記輔助選擇育種(MolecularMark-AssistSelection,MAS)，該技術是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現代分子生物學和傳統遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育。基因多態性是指不同物種或者同一物種內的不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的學者Lander(1996)提出的一類遺傳標記系統，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態性的90％以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1％的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1％時才被稱為單核苷酸多態性。它的變異形式有：顛換、轉換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的堿基變異的SNPs約占2/3。根據基因組中單核苷酸多態性產生的位置，可分為以下3類：基因編碼區單核苷酸多態性(Coding-regionSNPs,cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態性(PerigenicSNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態性(IntergenicSNPs,iSNPs)。研究表明，位于編碼區內的cSNP比較少。基因編碼區內的cSNP又可分為2種：一種是編碼區內的同義cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區內的非同義cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而導致蛋白質中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發現SNPs：即DNA序列測定方法、聚合酶鏈反應—單鏈構象多態(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP)與DNA測序結合法、等位特異性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因芯片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。限制性片段長度多態性-聚合酶鏈反應(RestrictionFragmentLengthPolymorphism-PolymeraseChainReaction，RFLP-PCR)方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后設計上下游引物用限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。KITLG(KITLigand，KL或KitL)是一種分泌生長因子，又被稱為干細胞因子(StemCellFactor，SCF)，肥大細胞因子(MastStemCellFactor，MCGF)或Steel因子(SteelFactor，SLF)，屬于酪氨酸激酶受體家族。KITLG由MgfcDNA編碼，由284個氨基酸組成。KITLGmRNA主要在卵泡的顆粒細胞中表達)。KITLG通過其受體KIT信號影響卵母細胞與顆粒細胞之間的相互作用。顆粒細胞中的KITLG和卵母細胞中的KIT之間的互作對動物繁殖是不可或缺的。KITLG在原始生殖細胞(PrimordialGermCells，PGCs)的生存、增殖、遷移以及卵泡的發育中發揮作用。KITLG在卵泡發育中也起很重要的作用。KITLG結合KIT誘發PI3K通路在其它多種信號通路協調下傳導信息，激活卵母細胞，促進卵母細胞的生長和分泌作用。雖然有關KITLG基因在動物繁殖方面的作用的研究取得了一些進展，但是在綿羊上的研究報道較少。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態性的方法及其應用，利用PCR-RFLP方法針對其基因位點上的突變進行檢測，提前淘汰劣勢個體，加快高繁種羊群體的建立。本專利技術通過以下技術方案來實現：綿羊KITLG基因第47569位為T或C的單核苷酸多態性的檢測方法為：以包含KITLG基因的待測綿羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增綿羊KITLG基因；用限制性內切酶SspI消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑒定綿羊KITLG基因第47569位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為：上游引物：5’-TTATCTCCAGCTTTAGGG-3’18nt；下游引物：5’-AAGGTGACTTTGGTGAAT-3’18nt。所述的PCR擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環；72℃延伸10min。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為1.5-3.0％的瓊脂糖凝膠電泳。根據瓊脂糖凝膠電泳結果KITLG基因第47569位堿基多態性為：TT型表現：358bp和110bp；CT型表現：468bp、358bp和110bp。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益的技術效果：本專利技術利用RFLP-PCR方法對綿羊KITLG基因第47569位點上的單核苷酸多態性進行檢測，該位點位于KITLG基因的第五內含子，該核苷酸多態性能夠本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，包括以下步驟：以待測綿羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增綿羊KITLG基因片段；用限制性內切酶SspI酶切PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑒定綿羊KITLG基因上單核苷酸多態性位點的基因型；所述的引物對P為：上游引物：5’?TTATCTCCAGCTTTAGGG?3’；下游引物：5’?AAGGTGACTTTGGTGAAT?3’。

【技術特征摘要】
1.一種檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，包括以下步驟：以待測綿羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增綿羊KITLG基因片段；用限制性內切酶SspI酶切PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑒定綿羊KITLG基因上單核苷酸多態性位點的基因型；所述的引物對P為：上游引物：5’-TTATCTCCAGCTTTAGGG-3’；下游引物：5’-AAGGTGACTTTGGTGAAT-3’。2.如權利要求1所述的檢測綿羊KITLG基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，所述的PCR擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環；72℃延伸10...

【專利技術屬性】
技術研發人員：樂祥鵬，張軍霞，李發弟，王維民，李萬宏，
申請(專利權)人：蘭州大學，
類型：發明
國別省市：甘肅;62