microRNA-34a-5p抑制劑在制備治療類風濕關節炎藥物中的應用制造技術

本發明專利技術公開了microRNA?34a?5p抑制劑在制備治療類風濕關節炎藥物中的應用。免疫系統的紊亂和失衡是引起自身免疫病發生和發展的主要原因，而microRNA在免疫調節中發揮著重要作用。本發明專利技術提出microRNA?34a?5p抑制劑可以作為生物免疫抑制劑治療類風濕關節炎。本發明專利技術涉及核酸干擾治療方法對于類風濕關節炎的治療價值，并且可以抑制體內的過度免疫活化狀態，本發明專利技術的提出旨在為類風濕關節炎的生物治療提供一條新途徑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種新型的自身免疫性疾病的生物治療方法，特別涉及microRNA-34a-5p抑制劑在類風濕關節炎治療中的應用。本專利技術屬于生物與新醫藥

技術介紹
自身免疫性疾病是指由于機體對自身抗原發生免疫應答而導致自身組織損害所引起的疾病。類風濕關節炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種常見的自身免疫性疾病，該病會導致進行性關節畸形和功能喪失，繼發多系統并發癥，減短患者壽命，同時給社會經濟帶來沉重的負擔。近年來，隨著多種新型生物制劑的出現，該類疾病得到更好的控制，但是仍然有一些難治性患者應用現在的治療無效，此外，藥物的不良反應也不可小覷，所以，進一步探索該類疾病的發病機制并且為患者提供新的治療藥物仍是一項重大任務。免疫系統的紊亂和失衡是引起自身免疫病發生和發展的主要原因。Th1以及Th17效應性細胞及其分泌的細胞因子在多種自身免疫性疾病的發病以及疾病進展中發揮著重要作用，Th1細胞分泌的TNF-α以及Th17細胞分泌的IL-17A和IL-17F可以活化白細胞以及滑膜成纖維細胞、抑制調節性T細胞的功能、激活破骨細胞、介導軟骨和骨的吸收。微小RNA(microRNAs)是指長度為18-22個核苷酸的單鏈非編碼內源性小RNA，是處于轉錄后水平的重要調節因子，可以通過與信使RNA的3’非翻譯區(untranslatedregion，UTR)結合使其降解或者使其喪失翻譯為蛋白的能力，從而發揮調節作用。目前，對于microRNA-34a-5p(以下簡稱miR-34a-5p)在類風濕關節炎中的應用尚無報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種新型的類風濕關節炎的生物治療方法，為了達到該目的，本專利技術采用了以下技術手段：本專利技術利用miR-34a-5p與免疫應答緊密相關的特性，將其抑制劑應用到RA等自身免疫性疾病的治療中，并應用動物模型驗證了該治療方法的可行性。具體的，本專利技術的技術方案是，利用miR-34a-5p的免疫學作用，將其抑制劑應用于膠原誘導性關節炎(collagen-inducedarthritis,CIA)小鼠的關節炎治療。首先，合成小鼠來源的miR-34a-5p抑制劑。然后，構建類風濕關節炎動物模型CIA關節炎小鼠模型，應用該抑制劑在造模后對小鼠進行治療，從關節炎評分觀察治療的療效，并分析該治療對T淋巴細胞亞群分布、炎癥性細胞因子的表達的影響。在上述研究的基礎上，本專利技術提出了miR-34a-5p抑制劑在制備治療類風濕關節炎藥物中的應用。在本專利技術中，優選的，所述的miR-34a-5p抑制劑的核苷酸序列是：5’ACAACCAGCUAAGACACUGCCA3’(SEQIDNO.1所示)。在本專利技術中，優選的，可對所述的miR-34a-5p抑制劑進行修飾。在本專利技術中，優選的，所述的修飾包括對miR-34a-5p抑制劑(SEQIDNO.1所示)的全鏈進行甲基化修飾，同時在5'端和3'端分別有2個和4個堿基硫代修飾，并在3'端連接有高親和性膽固醇修飾。相較于現有技術，本專利技術的有益效果是：1.本專利技術所涉及的抑制物為經過膽固醇等分子修飾的小分子量的核酸序列，可以有效的減少RNA酶對該抑制物的降解，同時脂溶性的增強可以使其更容易進入到細胞內發揮作用，為類風濕關節炎的生物治療提供了有效的方法，具有極大的社會和經濟效益價值。2.本專利技術中所涉及的miR-34a-5p抑制物能夠延遲小鼠關節炎的發病，改善關節炎癥狀。3.研究顯示應用miR-34a-5p抑制物治療類風濕關節炎能夠廣泛的降低免疫細胞的活化，減少病灶局部炎癥性細胞因子的表達。附圖說明圖1為miR-34a-5p抑制劑的結構示意圖；圖2為miR-34a-5p抑制劑可以延遲CIA小鼠的發病，改善關節炎癥狀；圖3為miR-34a-5p抑制劑可以降低CIA小鼠關節病灶局部炎癥性細胞因子的表達；**p<0.01,***p<0.001；圖4為miR-34a-5p抑制劑可以減少CIA小鼠淋巴結各Th細胞亞群轉錄因子的表達；**p<0.01,***p<0.001,ns無統計學意義；圖5為miR-34a-5p抑制劑可以對CIA小鼠脾臟各Th細胞亞群產生抑制作用。具體實施方式下面結合具體實施例和附圖來進一步描述本專利技術，本專利技術的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本專利技術的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本專利技術的精神和范圍下可以對本專利技術技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術的保護范圍內。實施例一miR-34a-5p抑制劑的設計與合成本專利技術中的miR-34a-5p抑制劑的核苷酸序列為：5’mAmCmAmAmCmCmAmGmCmUmAmAmGmAmCmAmCmUmGmCmCmA3’，其中m表示甲基化修飾，同時在5'端和3'端分別有2個和4個堿基硫代修飾，并在3'端連接有高親和性膽固醇修飾。miR-34a-5p抑制劑的結構示意圖如圖1所示。修飾后的miR-34a-5p抑制劑由生物公司進行合成。實施例二應用miR-34a-5p抑制劑對CIA小鼠的治療效果1、膠原誘導性關節炎(CIA)小鼠模型的建立：所有造模小鼠，第0天和21天于尾根部皮下注射100μg牛II型膠原。2、miR-34a-5p抑制劑治療CIA小鼠：用100μl生理鹽水溶解50nmolmiR-34a-5p抑制劑，在造模第28、31、35、38、41天尾靜脈注射，對照組CIA小鼠用100μl生理鹽水溶解等量的無意義的抑制物對照物進行尾靜脈注射作為參考。3、CIA小鼠的關節炎評價：CIA小鼠造模后每隔一天對CIA小鼠進行關節炎評分。評分采用雙盲法，評分標準：0分正常；1分紅腫涉及一個指關節；2分≥2個指關節或整個足爪輕度紅腫；3分整個足爪紅腫較重；4分重度紅腫，僵直，缺乏彈性。4、結果對照組以及治療組的小鼠的關節炎評分結果如圖2所示，從圖2可以看出miR-34a-5p抑制劑可以延遲CIA小鼠的發病，改善關節炎癥狀。實施例三應用miR-34a-5p抑制劑對CIA小鼠滑膜的細胞因子、淋巴結的轉錄因子的表達以及外周免疫細胞亞群分布的影響1、膠原誘導性關節炎(CIA)小鼠模型的建立：所有造模小鼠，第0天和21天于尾根部皮下注射100μg牛II型膠原。2、miR-34a-5p抑制劑治療CIA小鼠：用100μl生理鹽水溶解50nmolmiR-34a-5p抑制劑，在造模第28、31、35、38、41天尾靜脈注射，對照組CIA小鼠用100μl生理鹽水溶解等量的無意義的抑制物對照物進行尾靜脈注射作為參考。3、CIA小鼠滑膜的細胞因子、淋巴結的轉錄因子的表達以及外周免疫細胞亞群分布的測定1)第43天處死小鼠，分離髕骨和鄰近的滑膜組織，獲取脾臟以及關節的引流淋巴結。2)RealtimeRT-PCR檢測滑膜髕骨中細胞因子的表達。3)RealtimeRT-PCR檢測淋巴結中轉錄因子的表達。4)流式細胞術檢測脾臟各Th亞群的分布。4、結果CIA小鼠關節炎病灶局部炎癥性細胞因子的表達情況如圖3所示，其中圖3A為炎癥性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-21、IL-1β以及IFN-γ的表達情況，圖3B為炎癥性細胞因子IL-10、IL-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
microRNA?34a?5p抑制劑在制備治療類風濕關節炎藥物中的應用。

【技術特征摘要】
1.microRNA-34a-5p抑制劑在制備治療類風濕關節炎藥物中的應用。2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的microRNA-34a-5p抑制劑的核苷酸序列是：5’ACAACCAGCUAAGACACUGCCA3’。3.如權利要求2所述的應用，其特...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李洋，黨秋杰，
申請(專利權)人：哈爾濱醫科大學，
類型：發明
國別省市：黑龍江;23