一種利用siRNA以植物為發(fā)生器的生物農(nóng)藥制造技術

本發(fā)明專利技術屬于基因工程領域，涉及一種利用siRNA以植物為發(fā)生器的生物農(nóng)藥。所述的生物農(nóng)藥以表達針對害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的植物為原料。本發(fā)明專利技術中所述的siRNA是由轉基因植物所表達，被害蟲接觸或取食后會通過RNAi機制沉默其靶向的害蟲生命代謝關鍵基因。本發(fā)明專利技術針對設計特異靶向害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA，并創(chuàng)造性地將植物作為siRNA載體生產(chǎn)生物農(nóng)藥。通過將高靶向害蟲的siRNA模板序列轉入植物中，使植物表達相應的目標siRNA，大面積種植此種轉基因植物，將其提取物用于制造生物農(nóng)藥，此種農(nóng)藥對環(huán)境無危害、從基因?qū)用嫔蠚绾οx，阻礙害蟲發(fā)育，殺死效率高，不容易造成害蟲抗性。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程領域，涉及一種利用siRNA以植物為發(fā)生器的生物農(nóng)藥。
技術介紹
小干擾核糖核酸(siRNA)是一類由20多個核苷酸組成的雙鏈RNA分子，可以通過特異性降解靶基因的信使核糖核酸(messengerRNA，mRNA)起到沉默基因表達的作用，這一過程被稱為RNA干擾(RNAinterference，RNAi)，在基因調(diào)控和生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。RNA干擾(RNAi)是一種抗病毒機制。它是由dsRNA介導的序列特異性的同源基因的轉錄后的基因沉默，在細胞內(nèi)有效作用方式為siRNA。RNA干擾可以利用siRNA或siRNA表達載體特異地沉默靶基因，此方式快速、經(jīng)濟、簡便，且具有高度的序列專一性，可以獲得功能喪失或減低突變序列特異方式剔除目的基因表達，成為探索基因功能的重要研究手段。大量實驗證明,RNAi現(xiàn)象廣泛存在于生物界中,是生物抵御病毒侵染和阻斷轉座子的古老防御機制之一。隨著研究的不斷深入,RNAi的機制正在被逐步闡明,而同時作為功能基因組和基因治療研究中的有效工具,RNAi也越來越為人們所重視。有研究表明，siRNA可以成功敲出棉鈴蟲、小菜蛾和豌豆芽的部分抗藥基因，并且可以通過敲出昆蟲的乙酰膽堿酯酶起到防止蟲害的作用,從而在害蟲防治中的起到與農(nóng)藥相當?shù)淖饔谩Ｄ壳埃袌錾系霓r(nóng)藥根據(jù)原料來源可分為有機農(nóng)藥、無機農(nóng)藥、植物性農(nóng)藥、微生物農(nóng)藥。此外，還有昆蟲激素。根據(jù)加工劑型可分為粉劑、可濕性粉劑、可溶性粉劑、乳劑、乳油、濃乳劑、乳膏、糊劑、膠體劑、熏煙劑、熏蒸劑、煙霧劑、油劑、顆粒劑和微粒劑等。大多數(shù)是液體或固體，少數(shù)是氣體。農(nóng)藥流失到環(huán)境中，將造成嚴重的環(huán)境污染，有時甚至造成極其危險的后果。傳統(tǒng)農(nóng)藥會有以下缺點：1.污染大氣、水環(huán)境，造成土壤板結。2.增強病菌、害蟲對農(nóng)藥的抗藥性3.殺傷有益生物4.野生生物和畜禽中毒5.對人體健康的危害。為克服上述缺點，高效、低毒、低殘留是農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。雖然研究人員針對RNA干擾用于防治蟲害已有初步研究，但目前該技術仍有一些難以解決的問題限制其商業(yè)化發(fā)展。其中，如何遞送siRNA、如何對害蟲進行大面積撲殺是妨礙其應用的主要原因。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是針對現(xiàn)有技術的上述缺陷，提供一種用于制備生物農(nóng)藥的siRNA表達載體和含有該載體的細胞。本專利技術的另一目的是提供一種生物農(nóng)藥。本專利技術的又一目的是提供該生物農(nóng)藥的制備方法。本專利技術的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：一種生物農(nóng)藥，所述的生物農(nóng)藥以表達針對害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的植物為原料。本專利技術中所述的siRNA是由轉基因植物所表達，被害蟲接觸或取食后會通過RNAi機制沉默其靶向的害蟲生命代謝關鍵基因。其中，“生命代謝關鍵基因”是指在害蟲生命代謝中起重要作用的基因，本專利技術生物農(nóng)藥以表達針對害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的植物為原料。可用于本專利技術的針對害蟲生命代謝關鍵基因沒有特別限制，通常包括消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)特異性毒害基因、經(jīng)過表型篩選的影響昆蟲生長發(fā)育基因如昆蟲幾丁質(zhì)合成酶基因、蛻皮激素受體基因、谷胱甘肽-S-轉移酶基因等。針對害蟲生命代謝關鍵基因包括鱗翅目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰膽堿酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、V-ATPase基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因，更優(yōu)選地，在一實施例中包含針對害蟲生命代謝關鍵基因包括優(yōu)選鱗翅目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰膽堿酯酶基因。所述的生物農(nóng)藥，優(yōu)選通過基因工程手段構建表達高靶向害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的轉基因植物，種植此種轉基因植物，將轉基因植物或其提取物用于制造生物農(nóng)藥。所述的生物農(nóng)藥，進一步優(yōu)選將所述的轉基因植物的葉片或其他器官制備成粉劑作為生物農(nóng)藥；或者提取轉基因植物中所述的siRNA表達產(chǎn)物作為生物農(nóng)藥。在本專利技術中，可通過本領域常規(guī)技術手段將外源siRNA導入到載體，并在轉基因植物中表達。可用于本專利技術的植物種類沒有特別限制，通常包括禾本科、香蒲科、菊科、唇形科、百合科、石蒜科、紫草科、天南星科、傘形科、十字花科、報春花科、蓼科、藜科、石竹科、柳葉菜科、蕁麻科、車前草科、楊梅科、桑科、大麻科、虎耳草科、豆科、蕨科、堇菜科、銀齒萵苣科、莧科、殼斗科、小球藻科、茶科、茜草科、梧桐科、松科、葫蘆科、大風子科、羅漢松科、樺木科、胡桃科、胡椒科、木蘭科、齒菌科、木耳科、口蘑科、傘菌科、紅菇科、杜鵑花科、薔薇科、獼猴桃科、番杏科、葡萄科、番荔枝科、秋海棠科、鳳梨科、白花菜科、銀杏科、八角茴香科、姜科、石榴科、毛茛科、夾竹桃科、小檗科、蕓香科、茄科、罌粟科、馬鞭草科、鹿蹄草科、鴨跖草科、瑞香科、桑寄生科、蘿藦科、三白草科、景天科、鱗始蕨科、馬齒莧科、澤瀉科、錦葵科、玄參科、紫葳科、防已科、海金沙科、爵床科、旋花科、多孔菌科、無患子科、柏科、苦木科、大戟科、楝科、使君子科、忍冬科、檉柳科、列當科、燈心草科、金縷梅科、龍膽科、椴樹科、菖蒲科、冬青科、車前科、漆樹科、五味子科、五加科、木棉科、馬兜鈴科、木犀科、棕櫚科、睡蓮科、檀香科植物中的一種、或幾種的組合。優(yōu)選地，轉基因植物包括為生菜、水稻、小麥、玉米、花生、高粱、大豆、馬鈴薯、蕎麥、藜、薊、胡椒、八角、茴香、桃、杏、梨、蘋果、香蕉、猴頭、木耳、山藥、山楂、人參、當歸、番茄、辣椒、茄子、胡蘿卜、甘藍、花椰菜、大白菜、小白菜、油菜、菠菜、芥菜、豌豆、南瓜、黃瓜、西瓜、甜瓜、石刁柏、洋蔥、或其組合。更優(yōu)選地，轉基因植物包括生菜、苜蓿、黑麥草、大豆或水稻。所述的生物農(nóng)藥，也可優(yōu)選將所述siRNA在同一株植物中與至少一種不同于該siRNA靶標基因表達產(chǎn)物的第二種殺蟲蛋白質(zhì)一起表達或者在不同的植物中進行表達后混合作為生物農(nóng)藥的原料。其中，所述第二種殺蟲蛋白質(zhì)為Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。所述siRNA在同一株植物中與至少一種不同于該siRNA靶標基因表達產(chǎn)物的第二種殺蟲蛋白質(zhì)一起表達通過遺傳工程使植物包含并表達siRNA以及第二種殺蟲蛋白質(zhì)來實現(xiàn)；或者通過利用遺傳工程操作使第1親本植物表達siRNA和第2親本植物表達第二種殺蟲蛋白質(zhì)，再將第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。一種用于制備生物農(nóng)藥的siRNA表達載體，將針對害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的模板序列插入雙元表達載體所得；所述的針對害蟲生命代謝關鍵基因選自對害蟲消化系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)具有特異性毒害的基因、或經(jīng)過表型篩選的影響本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種生物農(nóng)藥，其特征在于所述的生物農(nóng)藥以表達針對害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的植物為原料。

【技術特征摘要】
1.一種生物農(nóng)藥，其特征在于所述的生物農(nóng)藥以表達針對害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的
植物為原料。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物農(nóng)藥，其特征在于所述的針對害蟲生命代謝關鍵基因選自對害
蟲消化系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)具有特異性毒害的基因、或經(jīng)過表型篩選的影響昆蟲生長發(fā)育的基因。
3.根據(jù)權利要求1所述的生物農(nóng)藥，其特征在于所述的針對害蟲生命代謝關鍵基因選自鱗翅
目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰膽堿酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、V-ATPase基因、Cathespin
基因、IAP基因、APN基因，優(yōu)選鱗翅目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰膽堿酯酶基因。
4.根據(jù)權利要求1～3中任一項所述的生物農(nóng)藥，其特征在于通過基因工程手段構建表達高靶
向害蟲生命代謝關鍵基因的siRNA的轉基因植物，種植此種轉基因植物，將轉基因植物或其提
取物用于制造生物農(nóng)藥。
5.根據(jù)權利要求4所述的生物農(nóng)藥，其特征在于將所述的轉基因植物的葉片或其他器官制備
成粉劑作為生物農(nóng)藥；或者提取轉基因植物中所述的siRNA表達產(chǎn)物作為生物農(nóng)藥。
6.根據(jù)權利要求5所述的生物農(nóng)藥，其特征在于所述植物選自禾本科、香蒲科、菊科、唇形
科、百合科、石蒜科、紫草科、天南星科、傘形科、十字花科、報春花科、蓼科、藜科、石竹
科、柳葉菜科、蕁麻科、車前草科、楊梅科、桑科、大麻科、虎耳草科、豆科、蕨科、堇菜科、
銀齒萵苣科、莧科、殼斗科、小球藻科、茶科、茜草科、梧桐科、松科、葫蘆科、大風子科、
羅漢松科、樺木科、胡桃科、胡椒科、木蘭科、齒菌科、木耳科、口蘑科、傘菌科、紅菇科、
杜鵑花科、薔薇科、獼猴桃科、番杏科、葡萄科、番荔枝科、秋海棠科、鳳梨科、白花菜科、
銀杏科、八角茴香科、姜科、石榴科、毛茛科、夾竹桃科、小檗科、蕓香科、茄科、罌粟科、
馬鞭草科、鹿蹄草科、鴨跖草科、瑞香科、桑寄生科、蘿藦科、三白草科、景天科、鱗始蕨科、
馬齒莧科、澤瀉科、錦葵科、玄參科、紫葳科、防已科、海金沙科、爵床科、旋花科、多孔菌
科、無患子科、柏科、苦木科、大戟科、楝科、使君子科、忍冬科、檉柳科、列當科、燈心草
科、金縷梅科、龍膽科、椴樹科、菖蒲科、冬青科、車前科、漆樹科、五味子科、五加科、木
...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張辰宇，洪治，曾科，
申請(專利權)人：江蘇命碼生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32