一種草分枝桿菌注射液的制備方法及草分枝桿菌注射液技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提出了一種草分枝桿菌注射液的制備方法，該方法采用原始菌種-主種子批-工作種子批三級(jí)培養(yǎng)的方式，最后工作種子批經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，分離、純化、滅菌，獲得草分枝桿菌原液。所述原液經(jīng)過(guò)聚山梨酯80和氯化鈉所配制的稀釋液的稀釋，直接得到草分枝桿菌注射液。按照本發(fā)明專利技術(shù)所提出的草分枝桿菌注射液制備方法，具有菌種保持性好、安全程度高、成本低、生產(chǎn)效率高的特點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及草分枝桿菌，特別涉及一種草分枝桿菌注射液的制備方法。
技術(shù)介紹
草分枝桿菌是抗酸分枝桿菌中的一種，基于其同結(jié)核分枝桿菌的生物親緣性，可介入人體的免疫過(guò)程，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫能力。滅活的草分枝桿菌進(jìn)入人體后可刺激T淋巴細(xì)胞釋放出多種淋巴因子如MAF，MIF，MCF，MMF等，這些因子作用于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使之向病灶部位聚集、活化，對(duì)病原菌進(jìn)行吞噬、殺傷和清除；同時(shí)，自然殺傷(NK)細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞也活化、增多；IgM，IgG趨正常，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。臨床驗(yàn)證結(jié)果證明，在免疫功能檢查中，T淋巴細(xì)胞亞群，T3，T4，T8，T4/T8明顯增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.001-0.002)，自然殺傷細(xì)胞，免疫球蛋白均明顯變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異(P＜0.01)，具有顯著免疫增強(qiáng)作用。對(duì)于草分枝桿菌的免疫增強(qiáng)乃至抗癌功能，目前在藥學(xué)、臨床學(xué)上都進(jìn)行了大量的研究，在文獻(xiàn)DE3728367C1中，披露了用草分枝桿菌對(duì)HIV感染者進(jìn)行免疫接種的方法，改善HIV感染者的生存狀況。在《新的免疫增強(qiáng)劑——草分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)和臨床研究》(實(shí)用癌癥雜志，2003.3，Vol.18，No.2)一文中，詳細(xì)報(bào)道了臨床上的草分枝桿菌對(duì)Lovo人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用》。文獻(xiàn)CN103396958A中，披露了一種動(dòng)物用草分枝桿菌及其免疫增強(qiáng)劑的制備方法，將菌種接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行種子培養(yǎng)后，直接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式雖然在一定程度上保證了菌種的純度及降低了變異幾率，然而，卻也限制了其產(chǎn)量。<br>為了擴(kuò)大草分枝桿菌的使用范圍，需要一種能夠工業(yè)化生產(chǎn)的草分枝桿菌注射液的制備方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提出了一種草分枝桿菌注射液的制備方法，包括以下步驟：a)將將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養(yǎng)基稀釋、分裝，完成原始種子批的建立，并在-70攝氏度環(huán)境下保存；b)對(duì)原始種子批菌種進(jìn)行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過(guò)濾、稀釋、接種于改良羅氏培養(yǎng)基上在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)120-150小時(shí)；c)將步驟b)中獲得的菌體進(jìn)行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)168-196小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成主種子批菌種，并進(jìn)行檢驗(yàn)；d)將檢驗(yàn)合格的主種子批菌種接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)196-240小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成工作種子批菌種，并進(jìn)行檢查；e)將工作種子批菌種通過(guò)復(fù)蘇、擴(kuò)增形成工作種子液，將工作種子液按照體積比1-5％的接種量將工作種子液接種到發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為35-42攝氏度，通氣量為0.5-1.5L/分鐘、以50-300rpm轉(zhuǎn)速的條件下培養(yǎng)360-450小時(shí)，收集之后用0.8-1.0％的NaCl沖洗液進(jìn)行沖洗、過(guò)濾，純化、滅菌之后即獲得草分枝桿菌原液；f)以聚山梨酯80和氯化鈉及注射用水混合，過(guò)濾配制成稀釋液，所述稀釋液中聚山梨酯80的體積百分比是0.05-0.4％，氯化鈉重量百分比是0.7-1.1％，其中過(guò)濾之后的稀釋液與草分枝桿菌原液混合，獲得草分枝桿菌藥液；g)將草分枝桿菌藥液灌封在清潔滅菌后的安瓿瓶中，終端滅菌檢漏后，即為草分枝桿菌注射液。如上所述的制備方法，其特征在于：所述蘇通培養(yǎng)基的配方是(單位：g/L)：天門(mén)冬素4g、枸櫞酸鹽2g、磷酸氫二鉀0.5g、MgSO4.7H2O0.5g、枸櫞酸鐵銨0.5g、甘油-6ml；調(diào)節(jié)PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進(jìn)行二次滅活，步驟為：對(duì)配制好的蘇通培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘；一次滅活完成后的蘇通培養(yǎng)基，在常溫下靜置4小時(shí)，然后以121攝氏度的溫度再次進(jìn)行滅活處理35分鐘，完成二次滅活處理。如上任一所述的方法，其特征在于：所述改良羅氏培養(yǎng)基的配方是(單位：g/L)：磷酸二氫鉀2.4、硫酸鎂0.24、檸檬酸鎂0.6、L-谷氨酸鈉7.2、孔雀綠0.4、馬鈴薯淀粉30，并調(diào)節(jié)PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進(jìn)行二次滅活，步驟為：對(duì)配制好的改良羅氏培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘；一次滅活完成后的改良羅氏培養(yǎng)基，在常溫下靜置4小時(shí)，然后以121攝氏度的溫度再次進(jìn)行滅活處理30分鐘，完成二次滅活處理。如上任一所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方是(單位：g/L)：磷酸二氫鉀1.5、磷酸氫二鈉1.5、硫酸銨0.5、硫酸鎂0.055、硫酸銅0.001、味精0.5、檸檬酸鈉0.45、瓊脂粉15、甘油6、酵母膏5、馬鈴薯淀粉15、葡萄糖5，然后再用濕熱滅菌法進(jìn)行滅活處理，具體方法是：將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘。本專利技術(shù)還提出了一種草分枝桿菌注射液，所述草分枝桿菌注射液是由如上任一所述的方法制備而成。本專利技術(shù)所提出的草分枝桿菌注射液的制備方法，適宜于規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，且顯著的降低了成本，能夠充分滿足患者需求。附圖說(shuō)明圖1草分枝桿菌原液的制備流程圖圖2從原液到注射液的制備流程圖具體實(shí)施方法實(shí)施例1一、草分枝桿菌原液的制備如圖1所示，草分枝桿菌原液采用三級(jí)培養(yǎng)的模式進(jìn)行制備，具體步驟如下：原始種子批的建立將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養(yǎng)基稀釋、分裝，完成原始種子批的建立，并在-70攝氏度環(huán)境下保存。所述蘇通培養(yǎng)基的配方是(單位：g/L)：天門(mén)冬素4g、枸櫞酸鹽2g、磷酸氫二鉀0.5g、MgSO4.7H2O0.5g、枸櫞酸鐵銨0.5g、甘油-6ml；調(diào)節(jié)PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進(jìn)行二次滅活，步驟為：對(duì)配制好的蘇通培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘；一次滅活完成后的蘇通培養(yǎng)基，在常溫下靜置4小時(shí)，然后以121攝氏度的溫度再次進(jìn)行滅活處理35分鐘，完成二次滅活處理。主種子批菌種的建立對(duì)原始種子批菌種進(jìn)行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過(guò)濾、稀釋、接種于改良羅氏培養(yǎng)基上在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)120-150小時(shí)；然后將獲得的菌體進(jìn)行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)168-196小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成主種子批菌種，并進(jìn)行檢驗(yàn)。所述改良羅氏培養(yǎng)基的配方是(單位：g/L)：磷酸二氫鉀2.4、硫酸鎂0.24、檸檬酸鎂0.6、L-谷氨酸鈉7.2、孔雀綠0.4、馬鈴薯淀粉30，并調(diào)節(jié)PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進(jìn)行二次滅活，步驟為：對(duì)配制好的改良羅氏培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘；一次滅活完成后的改良羅氏培養(yǎng)基，在常溫下靜置4小時(shí)，然后以121攝氏度的溫度再次進(jìn)行滅活處理30分鐘，完成二次滅活處理。工作種子批菌種的建立檢驗(yàn)合格的主種子批菌種接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在3本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種草分枝桿菌注射液的制備方法，包括以下步驟：a)將將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養(yǎng)基稀釋、分裝，完成原始種子批的建立，并在?70攝氏度環(huán)境下保存；b)對(duì)原始種子批菌種進(jìn)行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過(guò)濾、稀釋、接種于改良羅氏培養(yǎng)基上在30?40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)120?150小時(shí)；c)將步驟b)中獲得的菌體進(jìn)行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30?40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)168?196小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成主種子批菌種，并進(jìn)行檢驗(yàn)；d)將檢驗(yàn)合格的主種子批菌種接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30?40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)196?240小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成工作種子批菌種，并進(jìn)行檢查；e)將工作種子批菌種通過(guò)復(fù)蘇、擴(kuò)增形成工作種子液，將工作種子液按照體積比1?5％的接種量將工作種子液接種到發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為35?42攝氏度，通氣量為0.5?1.5L/分鐘、以50?300rpm轉(zhuǎn)速的條件下培養(yǎng)360?450小時(shí)，收集之后用0.8?1.0％的NaCl沖洗液進(jìn)行沖洗、過(guò)濾，純化、滅菌之后即獲得草分枝桿菌原液；f)以聚山梨酯80和氯化鈉及注射用水混合，過(guò)濾配制成稀釋液，所述稀釋液中聚山梨酯80的體積百分比是0.05?0.4％，氯化鈉重量百分比是0.7?1.1％，其中過(guò)濾之后的稀釋液與草分枝桿菌原液混合，獲得草分枝桿菌藥液；g)將草分枝桿菌藥液灌封在清潔滅菌后的安瓿瓶中，終端滅菌檢漏后，即為草分枝桿菌注射液。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種草分枝桿菌注射液的制備方法，包括以下步驟：
a)將將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養(yǎng)基稀釋、分裝，完成原
始種子批的建立，并在-70攝氏度環(huán)境下保存；
b)對(duì)原始種子批菌種進(jìn)行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過(guò)濾、稀釋、接
種于改良羅氏培養(yǎng)基上在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)120-150小時(shí)；
c)將步驟b)中獲得的菌體進(jìn)行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝
氏度的環(huán)境下培養(yǎng)168-196小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成主種子批菌種，并進(jìn)行檢
驗(yàn)；
d)將檢驗(yàn)合格的主種子批菌種接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝氏度的環(huán)境下
培養(yǎng)196-240小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成工作種子批菌種，并進(jìn)行檢查；
e)將工作種子批菌種通過(guò)復(fù)蘇、擴(kuò)增形成工作種子液，將工作種子液按照體積比1-5％
的接種量將工作種子液接種到發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為35-42攝氏度，通氣
量為0.5-1.5L/分鐘、以50-300rpm轉(zhuǎn)速的條件下培養(yǎng)360-450小時(shí)，收集之后用0.8-1.0％
的NaCl沖洗液進(jìn)行沖洗、過(guò)濾，純化、滅菌之后即獲得草分枝桿菌原液；
f)以聚山梨酯80和氯化鈉及注射用水混合，過(guò)濾配制成稀釋液，所述稀釋液中聚山
梨酯80的體積百分比是0.05-0.4％，氯化鈉重量百分比是0.7-1.1％，其中過(guò)濾之后的稀釋
液與草分枝桿菌原液混合，獲得草分枝桿菌藥液；
g)將草分枝桿菌藥液灌封在清潔滅菌后的安瓿瓶中，終端滅菌檢漏后，即為草分枝
桿菌注射液。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丁平，許邑，邱宇，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：成都金星健康藥業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：四川;51