一株海洋柴油降解菌BHB-16及其固定化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)篩選出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16，開發(fā)了一種可有效固定該菌株的方法并初步檢測(cè)了該固定化方法對(duì)石油降解率的影響。所述可高效降解柴油的細(xì)菌為BHB-16，保藏編號(hào)為CGMCC?No.11549，篩選自經(jīng)柴油處理后的沿海沉積物中，該菌可在含0.2％(v:v)柴油的2216E固體培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，通過(guò)分析其16s?DNA基因保守區(qū)域的核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，該菌株為L(zhǎng)utibacterium菌屬。以珊瑚石為吸附載體，該菌體可吸附在載體顆粒內(nèi)外表面，形成柴油降解菌BHB-16與珊瑚石顆粒高度、緊密結(jié)合的產(chǎn)物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了珊瑚石載體顆粒對(duì)BHB-16的固定作用。上述菌株及其固定化方法可應(yīng)用于海洋柴油降解過(guò)程中。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及微生物
，具體為篩選出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16，開發(fā)了一種可有效固定該菌株的方法并初步檢測(cè)了該固定化方法對(duì)石油降解率的影響。
技術(shù)介紹
近年來(lái)，柴油已成為海洋的主要污染物質(zhì)之一，主要通過(guò)沿海工業(yè)排放、海上油井、輸油管道及船舶泄漏等多種途徑進(jìn)入海洋，而此類情況不僅會(huì)嚴(yán)重影響所污染地區(qū)的生態(tài)環(huán)境，同時(shí)也間接阻礙了中國(guó)沿海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前，針對(duì)柴油污染，尤其是大面積柴油泄漏，通常采用物理法、化學(xué)法以及生物修復(fù)的方法予以處理。一些物理方法如人工打撈等往往適用于突發(fā)性溢油的回收并控制溢油的擴(kuò)散，但是處理效率受天氣、海洋狀況以及溢油類型影響；而如柴油乳化等化學(xué)方法，雖可以暫時(shí)清潔海面，但極易促使大量的原油沉降海底，引起海底荒漠化，進(jìn)而誘發(fā)二次污染。生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、操作簡(jiǎn)便、處理效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而現(xiàn)今被公認(rèn)為最有前景的海洋污染治理方法。由于自然環(huán)境的復(fù)雜性，使得直接投加外源高效降解菌在自然環(huán)境下的柴油污染修復(fù)中往往難以達(dá)到預(yù)期效果，這促使污染海洋的生物修復(fù)日漸轉(zhuǎn)向于依賴海洋微生物的降解作用，尤其是已經(jīng)適應(yīng)海底環(huán)境的各種土著柴油降解微生物，它們不僅可以克服海洋中各種極端條件，還可以以柴油為食，有效的對(duì)柴油進(jìn)行分解轉(zhuǎn)化，從而改變海洋生態(tài)環(huán)境。然而，由于許多微生物在水中通常以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，菌體極易流失，這使得降解菌的濃度偏低，對(duì)柴油等污染物無(wú)法達(dá)到明顯的降解效果。微生物固定化技術(shù)是從20世紀(jì)60年代開始迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，主要通過(guò)利用物理或化學(xué)的方法將微生物定位于限定的空間區(qū)域，具有微生物密度高、反應(yīng)迅速、微生物流失少等優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于柴油污染的生物治理有著極大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本研究篩選出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16，并以珊瑚石作為固定化載體,系統(tǒng)研究了該固定化材料對(duì)微生物的固定化效果以及固定化前后柴油降解菌株BHB-16對(duì)柴油的降解效率。本專利技術(shù)獲得一株可高效降解柴油的細(xì)菌，該菌株為BHB-16(Lutibacterium)，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCCNo.11549。本專利技術(shù)還公開一種對(duì)上文所述的細(xì)菌BHB-16的固定化方法，其步驟包括：①活化菌種BHB-16，菌濃度達(dá)OD600nm＝1.182～1.188；②將珊瑚石載體進(jìn)行清洗、煮沸和烘干后，利用排水法準(zhǔn)確稱量其體積；③向步驟②所得珊瑚石載體中加入2216E液體培養(yǎng)基，滅菌后，再加入步驟①所得細(xì)菌BHB-16，所加珊瑚石載體顆粒、2216E液體培養(yǎng)基以及菌液的體積比例為(10～14)mL:60mL:(0.4～0.5)mL；于28～30℃、80～120rpm/min搖床中培養(yǎng)28～30h后，完成珊瑚石載體對(duì)細(xì)菌BHB-16的固定化。其中,載體顆粒、2216E液體培養(yǎng)基以及菌液的體積比例為12mL:60mL:0.4mL，培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為80rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間為28h時(shí)，珊瑚石載體對(duì)細(xì)菌BHB-16菌液的固定化效果最佳。上文所述的對(duì)細(xì)菌BHB-16的固定化方法中，步驟①所述活化菌種BHB-16過(guò)程中使用的培養(yǎng)基為2216E液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為28～30℃、150～180rpm/min，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm/min時(shí)，菌體長(zhǎng)勢(shì)最好，菌濃度最高為OD600nm＝1.188。本專利技術(shù)上文所述的可高效降解柴油的細(xì)菌BHB-16在海洋柴油降解中有廣泛的應(yīng)用前景。本專利技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、本專利技術(shù)所述方法獲得的固定化BHB-16菌的操作簡(jiǎn)單，且珊瑚石載體顆粒對(duì)微生物無(wú)任何毒副污染，珊瑚石載體顆粒可以作為安全有效的吸附載體。2、本專利技術(shù)所述的固定化BHB-16菌的方法所使用的原材料價(jià)格低廉，當(dāng)珊瑚石載體顆粒完成對(duì)菌株BHB-16的固定化后，通過(guò)高溫滅菌、清洗處理和煮沸，進(jìn)而達(dá)到對(duì)固定化載體的回收利用，有助于資源的節(jié)約和環(huán)境的保護(hù)。3、通過(guò)本專利技術(shù)實(shí)施例的數(shù)據(jù)表明，本專利技術(shù)所述的BHB-16游離菌對(duì)柴油的降解率為52.2％，而通過(guò)本專利技術(shù)所述方法制得的固定化顆粒，具有很好的微生物活性，對(duì)柴油具有很好降解性能，降解率最高可達(dá)82.2％，相對(duì)于游離菌而言有效提高了30％。附圖說(shuō)明圖1為菌體的接種量對(duì)載體固定化效果的影響。其中，橫坐標(biāo)為菌體的接種量(mL)，縱坐標(biāo)為載體對(duì)菌液的吸附量(mL)。向含有12mL載體的60mL2216E液體培養(yǎng)基中，分別接種0.4、0.5、0.6、0.7和0.8mL處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的柴油降解菌BHB-16(OD600nm＝1.182～1.188)，檢測(cè)不同接種量對(duì)載體固定化效果的影響。結(jié)果如圖1所示，載體對(duì)菌株的固定化效果隨接種量的增大呈下降的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為0.4～0.5mL時(shí)，載體對(duì)BHB-16菌液的吸附量相對(duì)較多，于0.4mL時(shí)達(dá)到最大，即具有最優(yōu)固定化效果。由此確定固定化過(guò)程中菌株的接種量與培養(yǎng)基的體積比在(0.4～0.5)mL：60mL范圍內(nèi)，均可以達(dá)到較好的固定化效果，當(dāng)二者比例為0.4mL：60mL時(shí)，固定化效果最佳。圖2為菌株的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)載體固定化效果的影響。其中，橫坐標(biāo)為菌體對(duì)載體的吸附時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為載體對(duì)菌液的吸附量(mL)。向含載體量為12mL的60mL2216E液體培養(yǎng)基中接入0.4mL處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的石油降解菌BHB-16(OD600nm＝1.182～1.188)，于不同溫度下連續(xù)培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)后的24、26、28、30和32h時(shí)測(cè)定固定化載體對(duì)菌株的吸附量，進(jìn)而判斷其固定化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，珊瑚石對(duì)菌株的固定化效率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為28～30h時(shí)載體對(duì)菌株的吸附效果較好，在28h時(shí)，其吸附量達(dá)到最高。由此確定固定化過(guò)程中菌株最適的培養(yǎng)時(shí)間為28～30h，并且于28h時(shí)固定化效果最佳。圖3為載體投加量對(duì)其固定化效果的影響。其中，橫坐標(biāo)為載體投加量(mL)，縱坐標(biāo)為載體對(duì)菌液的吸附量(mL)。由圖3可見(jiàn)，珊瑚石載體對(duì)于菌株的固定化效率隨載體量增加均呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)載體投加量為10～14mL時(shí)，載體對(duì)菌株的吸附量較大，于12mL時(shí)，吸附量達(dá)到最高水平，載體固定化效果最好。由此確定，固定化過(guò)程中載體的投加量與培養(yǎng)基的體積比在10～14mL：60mL范圍內(nèi)，均可以達(dá)到較好的固定化效果，當(dāng)二者比例為12mL：60mL時(shí)，固定化效果最佳。圖4為固定化菌對(duì)柴油的降解效率。其中，橫坐標(biāo)為游離菌及固定化菌，縱坐標(biāo)為二者對(duì)柴油的降解效率(％)。如圖4所示，使用珊本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株可高效降解柴油的細(xì)菌，其特征在于，該菌株為BHB?16(Lutibacterium)，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC?No.11549。

【技術(shù)特征摘要】
1.一株可高效降解柴油的細(xì)菌，其特征在于，該菌株為BHB-16(Lutibacterium)，其在
中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCCNo.11549。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌BHB-16的固定化方法，其特征在于，步驟包括：
①活化菌種BHB-16，菌濃度達(dá)OD600nm＝1.182～1.188；
②將珊瑚石載體進(jìn)行清洗、煮沸和烘干后，利用排水法稱量其體積；
③向步驟②所得珊瑚石載體中加入2216E液體培養(yǎng)基，滅菌后，再加入步驟①所得細(xì)菌
BH...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：關(guān)曉燕，董穎，楊愛(ài)馥，陳仲，王擺，王召會(huì)，蔣經(jīng)偉，高杉，姜冰，蘇鶴聲，孫紅娟，姜北，周遵春，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：遼寧;21