一種快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術提供的快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒，所述多西環素核酸適配體核酸探針以納米磁球為內核，外表面鍵合有多西環素核酸適配體鏈；其中，多西環素核酸適配體鏈（多西環素核酸適配體人工序列）為：5’??GTA?CGG?AAT?TCG?CTA?GCC?GGG?CGG?CAG?GCC?ACG?GCT?GGG?GTT?GGT?CCC?ACT?GCG?GAT?CCG?AGC?TCC?ACG?TG?3’；所述試劑盒適配體探針是多西環素的新型識別元件，具有穩定性良好、靈敏度高、成本低、易制備、易修飾和標記的高特異性的優勢。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及對多西環素特異性識別DNA適配體的篩選方法及其應用，具體涉及生物技術和食品抗生素檢測領域。
技術介紹
多西環素(Doxycycline,)為四環素類抗生素(Tetracyclines)，通常用來治療動物傳染病，還被用作飼料添加劑，以預防疾病和促進動物生長。在實際工作中，由于隨意加大使用劑量和不遵守休藥期，造成藥物在動物組織中殘留。四環素類藥物長期殘留在動物組織中，導致耐藥菌在人類之間傳播，嚴重損害人體健康。很多國家和國際組織通過建立動物性食品中獸藥殘留的有效檢測方法，來控制藥物殘留問題。如，我國和歐盟對Dox在動物組織中殘留最高殘留限量(MRL)作了明確規定：肌肉、肝臟和腎臟的MRL分別為100μg/kg、300μg/kg和600μg/kg。為了控制獸藥殘留，保障人類健康，有必要建立一種快速、有效的殘留檢測方法對其殘留進行監測。最近報道的檢測多西環素(OTC)的方法主要包括高效液相色譜法、熒光法，質譜法和其它方法等。但是這些方法通常比較費時間并且價格相對昂貴，對實驗人員也有較高的要求，對樣品的預處理要求較高而不易推廣。免疫分析法是利用抗原抗體特異性結合反應檢測各種物質，在食品抗生素殘留檢測領域已較為廣泛地應用。酶聯免疫吸附測定(ELISA)將抗原和抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結合，有效保證分析中的高選擇性和高靈敏度，報道最多的是免疫分析方法。目前歐美已有一些公司生產針對抗生素殘留檢測的ELISA試劑盒產品，不過價格昂貴，酶標抗體的種類有限，只能檢測少數種類常見的抗生素殘留。由于多西環素是小分子化合物，本身不具有免疫原性，需將其與生物大分子如蛋白質連接后作為載體的抗原決定簇刺激動物才能產生特異性抗體，生產與應用存在較多的限制，包括：抗原偶聯合成，高效價抗體的篩選；產生于鼠、兔等動物的異源抗體在使用中有可能產生非特異性反應；抗體的制備成本高，費時費力，單克隆細胞株不易保存；批內批間檢測性能不穩定。這些都在很大程度上限制了免疫分析方法在多西環素檢測中的應用。核酸適配體是近年來發展起來的一類經體外人工合成而篩選出的單鏈寡核苷酸，能高效、特異性地結合各種生物目標分子，核酸適配體的出現為化學生物學界和生物醫學界提供了一種新的研究平臺。核酸適配體具有自身穩定性好、制備合成相對簡單、快速、易獲得、易功能化修飾與標記等優點，因此，在生物傳感器設計中應用靈活廣泛。近幾年，基于核酸適配體的生物傳感器研究受到人們極大的關注。目前已有利用核酸適配子為識別分子應用于食品中抗生素檢測的報道，檢測方法多以電化學生物傳感器為主。本專利技術針對傳統大型儀器不能實現現場快速檢測、前處理繁瑣、以及免疫分析方法需要制備抗體的缺點，建立了基于磁珠分離-適配體識別的熒光檢測方法，可用于食品中多西環素殘留的快速、高靈敏度檢測。
技術實現思路
本專利技術篩選到可以與多西環素高親和力結合的單鏈DNA適配體序列，建立了基于磁珠分離-適配體識別的熒光檢測方法，可用于動物源性食品中多西環素殘留的快速、高靈敏度檢測。本專利技術目的：在于提供一種測定多西環素的適配體的構建方法，鑒于多西環素分子的結構特點，設計了改良的磁珠SELEX技術優選多西環素的方法，借助基于SELEX的組合化學技術，篩選得到能特異性結合多西環素的DNA適配體。將適配體通過生物素-親和素系統固定于納米磁珠表面，與FAM標記的適配體互補鏈雜交，在不同的激發和發射波長下檢測互補鏈上熒光標記物。當加入靶分子時，核酸適配體與靶分子特異性結合，導致與其互補雜交的熒光標記DNA短鏈的解離，引起熒光強度的變化來定量分析樣品中多西環素。本專利技術提供的快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒，包括如下試劑為多西環素核酸適配體核酸探針、PBS緩沖液、解離液；其特征在于：所述多西環素核酸適配體核酸探針以納米磁球為內核，外表面鍵合有多西環素核酸適配體鏈；其中，多西環素核酸適配體鏈(多西環素核酸適配體人工序列)為：5’-GTACGGAATTCGCTAGCCGGGCGGCAGGCCACGGCTGGGGTTGGTCCCACTGCGGATCCGAGCTCCACGTG-3’具體參見附件：《核苷酸序列表》。所述解離液為900mL水中，8gNaCl，0.37gKCl，0.135gNa2HPO4.2H2O，1g葡萄糖，5gHEPES，溶解，NaOH調PH至7.05，定容至1000ml。所述適配體核酸探針的制備方法為：采用化學共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒，然后利用戊二醛法將氨基化的納米材料與親和素偶聯；將多西環素適配體修飾于納米磁珠表面，與多西環素適配體互補的雜交鏈在5’端分別標記了熒光基團，通過與適配體互補，構成熒光標記的適配體核酸探針。所述的快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒在檢測家禽肉類中多西環素殘留中的應用。本專利技術中所用的磁性納米粒子和適配體是重慶生物醫藥與器械研究中心實驗室合成。其中，上述探針是將多西環素適配體修飾于納米磁珠表面，分別熒光標記的適配體互補鏈雜交，加入目標分子后，核酸適配體與靶分子特異性結合，導致與其互補雜交的熒光標記DNA短鏈的解離，引起熒光強度變化，依據標準曲線求得樣品中多西環素的含量。上述的納米磁珠是采用化學共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒，然后利用戊二醛法將氨基化的納米材料與親和素偶聯。所述多西環素核酸適配體apt1的5’端均修飾了生物素，通過生物素-親和素系統，同時固定于親和素修飾的納米磁珠表面。與多西環素適配體互補的雜交鏈在5’端分別標記了熒光基團，通過與適配體互補，構成熒光標記核酸探針。一種快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒，包括如下試劑：上述所述的多西環素核酸適配體核酸探針、PBS緩沖液、解離液。上述所述的快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒，所述解離液為900mL水中，8gNaCl，0.37gKCl，0.135gNa2HPO4.2H2O，1g葡萄糖，5gHEPES，溶解，NaOH調PH至7.05，定容至1000ml。上述所述的快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒的制備方法，采用化學共沉淀法制備Fe3O4納米顆粒，然后利用戊二醛法將氨基化的納米材料與親和素偶聯。將多西環素適配體修飾于納米磁珠表面，與多西環素適配體互補的雜交鏈在5’端分別標記了熒光基團，通過與適配體互補，構成熒光標記的適配體核酸探針。具體為：1)在60mL乙二醇中加入13g的1,6-己二胺，4.0g無水醋酸鈉和2.0g六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，50℃攪拌，得膠體溶液，將溶液轉移到100mL帶聚四氟乙烯內襯的反應釜中，198℃反應6h；室溫冷卻，棄上層液體，去離子水沖出下層固體物質，磁分離收集；分別用去離子水和乙醇洗滌2次，50℃干燥5-10h；2)定量稱取納米材料懸浮于10mMPBS中，超聲分散15min，加入戊二醛溶液，使其終濃度為體積比5％；然后室溫振蕩2h，磁分離，棄上清，10mMPBS洗滌三次，除去多余的戊二醛；然后加入10mMPBS，超聲分散，加入一定量的親和素，室溫振蕩12h，磁分離，棄上清，10mMPBS清洗三次；3)將親和素修飾的納米材料懸浮于10mMPBS中超聲分散，加入一定濃度的核酸適配體溶液，室溫振蕩4h，磁分離，棄上清，10mMPB本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒，包括如下試劑為多西環素核酸適配體核酸探針、PBS緩沖液、解離液；其特征在于：所述多西環素核酸適配體核酸探針以納米磁球為內核，外表面鍵合有多西環素核酸適配體鏈；其中，多西環素核酸適配體鏈的核苷酸序列為：5’??GTA?CGG?AAT?TCG?CTA?GCC?GGG?CGG?CAG?GCC?ACG?GCT?GGG?GTT?GGT?CCC?ACT?GCG?GAT?CCG?AGC?TCC?ACG?TG?3’。

【技術特征摘要】
1.一種快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒，包括如下試劑為多西環素核酸適配體核酸探針、PBS緩沖液、解離液；其特征在于：所述多西環素核酸適配體核酸探針以納米磁球為內核，外表面鍵合有多西環素核酸適配體鏈；其中，多西環素核酸適配體鏈的核苷酸序列為：5’-GTACGGAATTCGCTAGCCGGGCGGCAGGCCACGGCTGGGGTTGGTCCCACTGCGGATCCGAGCTCCACGTG-3’。2.根據權利要求2所述的快速檢測多西環素殘留的核苷酸適配體探針試劑盒，其特征在于：所述解離液為900mL水中，8gNaCl，0.37gKCl，0...

【專利技術屬性】
技術研發人員：樂濤，張磊，孫琦，張志浩，
申請(專利權)人：重慶師范大學，
類型：發明
國別省市：重慶;50