一種測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種同時測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法，包括以下步驟：(1)供試品溶液的制備；(2)LC?MS/MS進行檢測；(3)成分的定性分析。在珠芽蓼成分定性分析的基礎(chǔ)上制備對照品溶液，還可以對其中綠原酸和沒食子酸的含量進行測定。本發(fā)明專利技術(shù)首次對珠芽蓼中有機酸和黃酮兩類活性成分中的10種物質(zhì)同時進行測定，完善了珠芽蓼藥材質(zhì)量控制方法。采用LC?MS/MS分析檢測方法結(jié)合多波長切換程序，具有簡便、穩(wěn)定、快速、高效、靈敏度高、重復(fù)性好、干擾小的優(yōu)點，能夠在1小時內(nèi)完成10種物質(zhì)的檢測，獲得一張能夠同時包含多個波長信息的色譜圖。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
專利
本專利技術(shù)屬于采用現(xiàn)代分析檢測手段對藏藥材的質(zhì)量進行檢測的
，更具體的說是利用多波長切換測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法。
技術(shù)介紹
珠芽蓼是蓼科植物珠芽蓼(PolygonumViviparumL)的干燥根莖，《晶珠本草》中記載，然布(珠芽蓼)味甘、澀、酸，有止瀉，鎮(zhèn)腸寒痛的功效。可用于治風(fēng)熱，除時疫熱，能調(diào)和和合紊亂，治衰老病，風(fēng)濕病，亦能退燒、調(diào)經(jīng)、收斂、止血等。《中國藏藥》記載，珠芽蓼主含蒽醌、鞣質(zhì)、多糖、黃酮苷、香豆精、有機酸、脂肪酸等成分，現(xiàn)有研究亦表明珠芽蓼中含有揮發(fā)油、鞣質(zhì)、黃酮、多糖等多種成分，其中沒食子酸和綠原酸等有機酸類成分具有抗氧化等作用，黃酮類成分具有較強的抗自由基作用和抗氧化能力。珠芽蓼記載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥(第一冊)》，其中僅有對藥材進行顯微鑒別沒有含量測定指標(biāo)，不利于有效控制珠芽蓼的質(zhì)量。目前有續(xù)艷麗等報道的《RP-HPLC法同時測定藏藥珠芽蓼中牡荊素、槲皮苷和槲皮素的含量》和李居安等報道的《HPLC法同時測定珠芽蓼中沒食子酸、綠原酸和槲皮素成分的含量》對珠芽蓼中的有機酸和黃酮類成分進行定量研究，都僅能對3種物質(zhì)進行測定，不能全面反映藥材的質(zhì)量，無法實現(xiàn)對珠芽蓼藥材進行全面和整體評價。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于針對以上缺陷和不足，建立一種不同時段多波長切換的LC-MS/MS圖譜技術(shù)同時檢測珠芽蓼中多種有機酸和黃酮類成分的方法。本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一方面，本專利技術(shù)提供了一種測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：1)供試品溶液的制備：將珠芽蓼粉末利用甲醇溶液提取制備成供試品溶液；2)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件：高效液相色譜條件：AgilentZORBAXSB-Aq色譜柱，其尺寸為150mm×4.6mm×5μm，流動相A為0.1％甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速為0.8mL·min-1，DAD檢測器檢測波長：272nm、325nm、360nm，在不同時段切換，柱溫30℃；進樣量10μL；流動相梯度洗脫程序為：不同時段波長切換程序為：質(zhì)譜條件：四級桿質(zhì)譜，離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子模式；離子掃描范圍：100-1000m/z；碰撞誘導(dǎo)解離電壓Fragmentor：70V；霧化壓力：50psi；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：12L/min；毛細(xì)管電壓：3000V；3)成分分析：通過化學(xué)工作站檢索NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，同時結(jié)合有關(guān)質(zhì)譜圖文獻解析，定性分析確認(rèn)珠芽蓼中有機酸類和黃酮類成分。在一些實施例中，供試品溶液的制備步驟包括：精密稱取過3號篩的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇溶液30mL，稱定重量，超聲提取，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾。在一些實施例中，所述成分分析還包括定量分析，按如下步驟進行：(a)對照品溶液的制備：取需要定量測定成分的對照品加甲醇溶劑制成對照品溶液；(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取對照品溶液稀釋多個濃度，以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸計算，得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍；(c)樣品含量測定：應(yīng)用不同時段多波長測定后的HPLC圖譜數(shù)據(jù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計算樣品中需要測定成分的含量。在一些實施例中，所述成分分析為對樣品中沒食子酸和綠原酸進行定量分析測定，按如下步驟進行：(a)對照品溶液的制備：混合對照品：取沒食子酸和綠原酸對照品加甲醇溶液制成沒食子酸、綠原酸的混合對照品溶液；沒食子酸對照品溶液：取沒食子酸加甲醇溶液制成沒食子酸對照品溶液；綠原酸對照品溶液：取綠原酸加甲醇溶液制成綠原酸對照品溶液；(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取混合對照品溶液稀釋，以沒食子酸和綠原酸信噪比大于10的稀釋液為定量限溶液。分別精密吸取定量限溶液10μL、混合對照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入色譜儀，以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸計算，得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍；(c)樣品含量測定：應(yīng)用不同時段多波長測定后的HPLC圖譜數(shù)據(jù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計算樣品中沒食子酸和綠原酸成分的含量。在一些實施例中，所述成分分析還包括對定量分析后進行有效性評價，其中包括系統(tǒng)適用性、專屬性、定量限與線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及加樣回收率。在一些實施例中，所述甲醇溶液為50％甲醇水溶液。在一些實施例中，步驟1)所述供試品溶液的制備中的超聲提取溫度為55℃，超聲時間為15min。在一些實施例中，所述有機酸類和黃酮類成分包括沒食子酸、異綠原酸、表兒茶素二聚體、表兒茶素/兒茶素、紫丁香苷、綠原酸、異槲皮苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷異構(gòu)體、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。本專利技術(shù)所述的多波長切換同時測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法所具有的積極效果在于：①本專利技術(shù)首次對珠芽蓼中有機酸和黃酮兩類活性成分中的10種物質(zhì)同時進行測定，完善了珠芽蓼藥材質(zhì)量控制方法。②本專利技術(shù)采用LC-MS/MS分析檢測方法具有簡便、穩(wěn)定、快速、高效、靈敏度高、重復(fù)性好、干擾小的優(yōu)點，能夠在1小時內(nèi)完成10種物質(zhì)的檢測，且分離度良好。在建立對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上，還能夠?qū)ζ溥M行定量分析檢測，從而獲得極其豐富的信息量。③本專利技術(shù)通過多波長切換程序，在保證數(shù)據(jù)信息損失最小的前提下，獲得一張能夠同時包含多個波長信息的色譜圖。④本專利技術(shù)的中供試品用50％甲醇為提取溶劑，料液比1:30，采用55℃超聲15min提取后過濾即可直接檢測，樣品前處理步驟簡單，提取效率也較高，無需過柱純化，且液相色譜分離過程中干擾雜質(zhì)少。⑤本專利技術(shù)采用以乙腈-水為流動相，加入0.1％的甲酸調(diào)節(jié)pH，使得各峰的峰形較好，分離時間適中且分離度良好，也達到了增加各成分的離子化效果。附圖說明圖1不同時段多波長切換珠芽蓼成分的HPLC圖譜，1-10分別為沒食子酸、異綠原酸、表兒茶素二聚體、表兒茶素/兒茶素、紫丁香苷、綠原酸、異槲皮苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷異構(gòu)體、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。圖2沒食子酸和綠原酸混合對照品溶液的HPLC色譜圖。圖3沒食子酸和綠原酸對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液HPLC圖譜的比較圖。圖4沒食子酸對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5綠原酸對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本專利技術(shù)作進一步的詳細(xì)描述。實施例11.試劑、藥材、標(biāo)準(zhǔn)品和儀器1.1試劑和藥材1.2標(biāo)準(zhǔn)品1.3儀器2.供試品溶液的制備精密稱取過3號篩的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞錐形瓶中，精密量取30mL50％甲醇，稱定重量，置于55℃超聲儀中超聲15min，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，再經(jīng)0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。3.LC-MS/MS的液相色譜及質(zhì)譜條件3.1LC-MS/MS的液相色譜條件AgilentZORBAXSB-Aq色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，按表1進行梯度洗脫，流速：0.8mL·min-1，檢測波長：272nm、325nm、360nm在不同時段的切換程序按表2進行。DAD檢測器在不同時段進行多波長切換；本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：1)供試品溶液的制備：將珠芽蓼粉末利用甲醇溶液提取制備成供試品溶液；2)高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用分析條件：高效液相色譜條件：Agilent?ZORBAX?SB?Aq色譜柱，其尺寸為150mm×4.6mm×5μm，流動相A為0.1％甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速為0.8mL·min?1，DAD檢測器檢測波長：272nm、325nm、360nm，在不同時段切換，柱溫30℃；進樣量10μL；流動相梯度洗脫程序為：不同時段波長切換程序為：質(zhì)譜條件：四級桿質(zhì)譜，離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子模式；離子掃描范圍：100?1000m/z；碰撞誘導(dǎo)解離電壓Fragmentor：70V；霧化壓力：50psi；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：12L/min；毛細(xì)管電壓：3000V；3)成分分析：通過化學(xué)工作站檢索NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，同時結(jié)合有關(guān)質(zhì)譜圖文獻解析，定性分析確認(rèn)珠芽蓼中有機酸類和黃酮類成分。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種測定珠芽蓼中有機酸和黃酮類成分的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：1)供試品溶液的制備：將珠芽蓼粉末利用甲醇溶液提取制備成供試品溶液；2)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件：高效液相色譜條件：AgilentZORBAXSB-Aq色譜柱，其尺寸為150mm×4.6mm×5μm，流動相A為0.1％甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速為0.8mL·min-1，DAD檢測器檢測波長：272nm、325nm、360nm，在不同時段切換，柱溫30℃；進樣量10μL；流動相梯度洗脫程序為：不同時段波長切換程序為：質(zhì)譜條件：四級桿質(zhì)譜，離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子模式；離子掃描范圍：100-1000m/z；碰撞誘導(dǎo)解離電壓Fragmentor：70V；霧化壓力：50psi；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：12L/min；毛細(xì)管電壓：3000V；3)成分分析：通過化學(xué)工作站檢索NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，同時結(jié)合有關(guān)質(zhì)譜圖文獻解析，定性分析確認(rèn)珠芽蓼中有機酸類和黃酮類成分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，供試品溶液的制備步驟包括：精密稱取過3號篩的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇溶液30mL，稱定重量，超聲提取，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述成分分析還包括定量分析，按如下步驟進行：(a)對照品溶液的制備：取需要定量測定成分的對照品加甲醇溶劑制成對照品溶液；(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取對照品溶液稀釋多個濃度，以對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸計算，得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍；(c)樣品含量測定：應(yīng)用不同時段多波長...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：廖娜，錢正明，艾中，李文佳，陶盛昌，龔歡，
申請(專利權(quán))人：廣東東陽光藥業(yè)有限公司，宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44