一種帶熒光標簽的SRAP標記方法技術

本發明專利技術公開了一種帶熒光標簽的SRAP標記方法，其正向引物為帶熒光標簽的引物。本發明專利技術FSRAP檢測方式于穩定性好、品種間多態性豐富、分辨率高，應用前景良好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種帶熒光標簽的SRAP標記(FluorescentSRAP,FSRAP)方法。
技術介紹
SRAP(Sequence－relatedamplifiedpolymorphism)是2001年美國加州大學的Li和Quiros[Lietal.TheoApplGenet,2001,103:455-461]開發的一種基于PCR的分子標記，它克服了RFLP、RAPD、SSR和AFLP等標記的缺點，如:RFLP標記對DNA濃度、純度的要求高；RAPD存在共遷移，無法鑒別雜合子和純合子，穩定性和重復性差，且產率低；AFLP的成本昂貴且步驟復雜；SSR的引物開發耗時長等缺點。因此，SRAP分子標記具有經濟、操作簡便、產率高、穩定及便于克隆目標片斷的特點，已廣泛應用于遺傳多樣性分析、種質鑒定、比較基因組學和遺傳連鎖圖的構建等研究。SRAP分子標記是對ORFs(Openreadingframes，開放式閱讀框)通過特定的引物設計進行擴增。研究表明基因外顯子G、C含量豐富，內含子A、T豐富。SRAP分子標記共有正向和反向兩套引物。正向引物中使用“CCGG”序列，是為了使之特異結合開放閱讀框區域中的外顯子。由于不同個體中外顯子序列通常是保守的、低多態性水平的，這使得外顯子無法做為標記。富含AT的區域通常出現在啟動子和內含子中，反向引物的核心序列為AATT，特異性結合AT富含區，擴增出基于內含子和外顯子的SRAP多態性標記。不同的物種，不同的個體，由于內含子、啟動子與間隔長度不同，而產生多態性擴增產物。引物是SRAP分子標記的關鍵。PCR反應體系中使用一對SRAP分子標記引物：正向引物長17bp，5`端的前10bp是一段非特異性的填充序列，緊接著是CCGG,它們一起組成核心序列,然后是靠著3`的是3個選擇性堿基，3個可選擇性的堿基是可以變化的，它的變化能產生一系列的引物，它們有著共同的核心序列。反向引物長18bp,即由5`的11個無特異性的填充序列和緊接著的AATT組成的核心序列,及3`的3個選擇性堿基，對內含子和啟動子區域進行特異擴增。SRAP分子標記最早是在蕓薹作物中開發利用的，到目前為止，SRAP標記已在小麥、水稻、擬南芥、棉花、馬鈴薯、番茄、辣椒、芹菜等植物遺傳多樣性分析中得到廣泛應用，具有重復性好、操作簡便、共顯性高、條帶易分離等優點，適合遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、種質資源的鑒定評價、重要性狀基因標記等生物學研究。專利技術人從2008年開始利用SRAP標記進行的遺傳多樣性、近等基因系的評價和遺傳圖譜的構建等研究，先后利用SRAP標記研究了中國半夏屬植物的親緣關系[歐陽鐘鳴,趙靜,彭正松,楊在君,魏淑紅.中國半夏屬植物親緣關系的SRAP分析,植物科學學報,2012,30(2):116-121.]；利用SRAP標記評價了小麥三雌蕊近等基因系[楊在君,彭正松,周永紅,彭麗娟,魏淑紅.利用SRAP分子標記評價小麥三雌蕊近等基因系的遺傳背景,2012,26(1):22-27.]；以及利用SRAP標記定位了小麥三雌蕊基因Pis1[文章已接受]。經過多年的研究，專利技術人發現，雖然SRAP標記具有眾多的優點，但操作起來仍然比較耗時，這主要是受銀染和顯影耗時較長的影響，同時普通聚丙烯酰胺凝膠電泳一般使用1mm的膠，分辨率和穩定性都不太理想。因此，開發出操作簡單、分辨率高和穩定性好SRAP標記(FluorescentSRAP,FSRAP)對遺傳多樣性研究、遺傳圖譜的構建以及分子標記輔助育種均具有重大的意義。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術提供了一種新的帶熒光標簽的SRAP標記(FluorescentSRAP,FSRAP)方法。本專利技術帶熒光標簽的SRAP標記方法，其正向引物為帶熒光標簽的引物。優選地，所述熒光標簽是IRDye700或IRDye800。所述標記方法的步驟如下：(1)提取待檢樣本中的DNA；(2)用正向引物為帶熒光標簽的引物對進行PCR擴增；(3)結果檢測：對DNA擴增結果進行檢測。步驟(2)中，所述擴增的體系為：1×PCRbuffer,Mg2+1.8mmol/L,dNTP0.15mmol/L，正反向引物各0.4μmol/L，DNA模板20ng,Taq酶1U，反應體系為10μL。步驟(2)中，所述PCR擴增的程序為：94℃預變性5min；94℃變性40s,35℃復性60s,72℃延伸60s,共5個循環；94℃40s,50℃60s，72℃1min，共35個循環；72℃繼續延伸10min,4℃保溫。步驟(3)中，所述檢測的方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染電泳或利用遺傳分析系統LI-COR4300電泳的方法。本專利技術還提供了一種鑒定小麥品種MY29和MY29TP的方法，它是采用采用SEQIDNO.3～6所示的引物對1(即以SEQIDNO.3所示引物為正向引物，SEQIDNO.6所示引物為反向引物)或者SEQIDNO.15～6所示的引物對2(即以SEQIDNO.15所示引物為正向引物，SEQIDNO.6所示引物為反向引物)，按照前述方法進行檢測。本專利技術FSRAP檢測方式于穩定性好、品種間多態性豐富、分辨率高，同時可以有效區分小麥的不同品種，檢測快速，應用前景良好。下面通過具體實施方式對本專利技術做進一步詳細說明，但是并不是對本專利技術的限制，根據本專利技術的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本專利技術上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。附圖說明圖1FSRAP正向引物結構圖2FSRAP標記和普通SRAP標記比較。A:普通SRAP標記結果，B:FSRAP標記結果圖3引物組合me1-em30擴增結果。M:marker，箭頭所在位置表示差異條帶圖4利用FSRAP標記構建的小麥遺傳圖譜圖5利用FSRAP標記鑒定小麥品種MY29和MY29TP具體實施方式1、下列實施例中所用實驗材料、試劑與儀器如下：(1)實驗材料小麥栽培品種綿陽29(MY29)由四川省農業科學院生物技術與核技術研究所的楊武云研究員提供。小麥三雌蕊近等基因系MY29TP及MY29×MY29TP雜交的F2群體(共200個單株)，均為專利技術人所在實驗室培育。(2)所用試劑植物DNA提取試劑盒(多糖多酚樣本)為Biotechnology品牌；50-700bpDNAmarker購自成都蘭博生物科技有限公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成；PCR反應所需試劑購自寶生物(大連)有限公司。(3)所用儀器BIO-RADT100PCR儀為BIO-RAD公司產品；NanoDrop2000超微量分光光度為Thermo公司產品；LI-COR4300遺傳分析系統為LI-COR公司產品。2、DNA提取利用植物DNA提取試劑盒(Biotechnology)提取29(MY29)，MY29，MY29×MY29TP雜交的F2群體(200個單株)的DNA，具體操作參照試劑盒說明書。用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度。DNA溶液的ODA260/A280值應為1.8-2.0。3、引物序列本實施例中所用引物序列如表1所示，正向引物的5`端加上了一個熒光標簽IRDye700或IRDye800。表1本實施例中所用引物序列實施例1FS本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種帶熒光標簽的SRAP標記方法，其特征在于：其正向引物為帶熒光標簽的引物。

【技術特征摘要】
1.一種帶熒光標簽的SRAP標記方法，其特征在于：其正向引物為帶熒光標簽的引物。2.根據權利要求1所述的標記方法，其特征在于：所述熒光標簽是IRDye700或IRDye800。3.根據權利要求1所述的標記方法，其特征在于：步驟如下：(1)提取待檢樣本中的DNA；(2)用正向引物為帶熒光標簽的引物對進行PCR擴增；(3)結果檢測：對DNA擴增結果進行檢測。4.根據權利要求3所述的標記方法，其特征在于：步驟(2)中，所述擴增的體系為：1×PCRbuffer,Mg2+1.8mmol/L,dNTP0.15mmol/L，正反向引物各0.4μmol/L，DNA模板20ng,Taq酶1U，反應體系為10μL。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊在君，張莉，彭正松，
申請(專利權)人：西華師范大學，
類型：發明
國別省市：四川;51