秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用技術

本發明專利技術公開了一種秦川牛microRNA?320a?1基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用，以待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P2為引物，PCR擴增秦川牛microRNA?320a?1基因片段；用限制性內切酶PvuII消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定秦川牛microRNA?320a?1基因rs518926539:C>T的單核苷酸多態性。本發明專利技術提供的檢測方法為利用microRNA?320a?1基因SNP與生長性狀的關系進行秦川牛肉用生長性狀的標記輔助選擇奠定了基礎，有利于快速建立遺傳資源優良的秦川牛種群。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的方法。
技術介紹
單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是生物基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的變異。研究表明，基因組DNA序列發生單核苷酸替換，會造成DNA序列的改變或編碼蛋白質的氨基酸發生改變，從而使不同基因型的生物體表現出不同的性狀。MicroRNAs是生物基因組DNA轉錄產生的一類長約22nt的非編碼RNA，研究表明，microRNAs發揮作用的方式是與下游靶基因的mRNA堿基互補配對，使該mRNA降解或翻譯受到抑制，從而影響生物體的性狀。目前，對microRNA-320a基因的研究多集中在人類，主要包括該基因與癌細胞的轉移和侵染等相關研究，未見microRNA-320a基因在黃牛上的遺傳變異研究。黃牛microRNA-320a基因包括2個亞型，分別是microRNA-320a-1和microRNA-320a-2，這兩個亞型發揮作用的途徑相同。目前黃牛microRNA-320a-1基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因多態位點的功能研究及其遺傳變異與生長發育性狀(如：體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍等性狀)關聯研究仍是空白。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的檢測方法及其應用，加快具有優質經濟性狀秦川牛種群的建立。為達到上述目的，本專利技術采用了以下技術方案：以包含microRNA-320a-1基因的待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P2為引物，PCR擴增秦川牛microRNA-320a-1基因片段；用限制性內切酶PvuII消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的單核苷酸多態性；所述的引物對P2為：上游引物：AACTCCCACGTTGCGTCCAGC21nt；下游引物：GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT20nt。所述的PCR擴增反應程序為：94℃預變性2min；94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸15s，30～36個循環；72℃延伸5min。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為3％的瓊脂糖凝膠電泳。所述的瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的單核苷酸多態性為：CC基因型表現為188bp條帶；CT基因型表現為188bp、168bp和20bp條帶；TT基因型表現為168bp和20bp條帶；其中，TT基因型為突變純合基因型。本專利技術具有以下有益的技術效果：本專利技術提供的秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性檢測方法，針對(rs518926539:C>T)位點由C突變為T的突變，通過在設計的上游引物的3’端引入堿基錯配，構造出被限制性內切酶PvuII所識別的切割位點。當沒有突變發生時，PCR擴增microRNA-320a-1基因后在錯配位置附近無法形成限制性內切酶PvuII識別位點；當由C突變為T時，PCR擴增microRNA-320a-1基因后可形成PvuII識別位點。通過瓊脂糖凝膠電泳可以準確、快速的檢測microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性：CC基因型表現為188bp條帶；CT基因型表現為188bp、168bp和20bp條帶；TT基因型表現為168bp和20bp條帶。可以對秦川牛群體的microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的等位基因和基因型頻率的變化進行監控。同時，由于秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的多態性與秦川牛體重、體長、十字部高等生長性狀相互關聯，本專利技術提供的檢測方法為利用microRNA-320a-1基因SNP與生長性狀的關系進行秦川牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)奠定了基礎，可快速建立遺傳資源優良的秦川牛種群。附圖說明圖1為分型引物(引物對P2)設計思路示意圖；圖2為錯配引入PvuII酶切位點PCR產物酶切后鑒定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點處單核苷酸多態性的電泳檢測結果；其中DL500為Marker所在列。圖3為秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點處SNP的不同基因型(CC、CT、TT)測序圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本專利技術做進一步的詳細說明，所述是對本專利技術的解釋而不是限定。本專利技術通過對秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位點的單核苷酸多態性進行檢測，以便用于中國秦川牛肉用生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的秦川牛種群。1、秦川牛microRNA-320a-1基因含(rs518926539:C>T)突變的PCR引物的設計以NCBI所公布的海福特牛(GCF_000003055.6)序列為參考，利用Primer5.0設計能夠擴增包含秦川牛microRNA-320a-1基因及其上下游各200bp的PCR引物對P1，其引物序列如下：上游引物F1(SEQ.ID.NO.1)：CCGAGCCCAGCCTAGAGC18nt；下游引物R1(SEQ.ID.NO.2)：CGCACCCCTTCGCACCCA18nt；以上述引物對秦川牛基因組擴增，能夠擴增秦川牛microRNA-320a-1基因的488bp片段，其中包含突變堿基的序列部分。由于在此SNP位點處無自然酶切位點，不能通過直接酶切檢測，而如果人工設計PCR引物錯配，將CAGA(如圖1下劃線所示序列)錯配為CAGC，在沒有突變發生時，PCR擴增microRNA-320a-1基因后在錯配位置附近無法形成限制性內切酶PvuII識別位點而由C突變為T時，PCR擴增microRNA-320a-1基因后可形成PvuII識別位點這樣就可以對該位點SNP多態性進行檢測。所設計PCR擴增引物對P2為：上游引物F2(SEQ.ID.NO.3)：TTCTCCCACGTTGCGTCCAGC21nt；下游引物R2(SEQ.ID.NO.4)：GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT20nt。其中，上游引物第21bp的A被錯配成C；引物對P2擴增的基因片段在引物對P1擴增的基因片段內部，大小是188bp，酶切分型后的電泳檢測如圖2所示。2、以引物對P2PCR擴增待測秦川牛的microRNA-320a-1基因片段(1)秦川牛樣本采集及基因組DNA提取1)秦川牛樣本的采集本專利技術具體以中國優良秦川牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1：陜西秦川牛(N＝227)，采集時間2014年6月；表1.秦川牛樣本的采集2)血樣基因組DNA的分離、提取a)冷凍血樣(主要為血細胞)室溫解凍，轉移500μL至1.5mLEppendorf離心管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心10mi本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種秦川牛microRNA?320a?1基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：以待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P2為引物，PCR擴增秦川牛microRNA?320a?1基因片段；用限制性內切酶PvuII酶切PCR擴增得到的片段，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定秦川牛microRNA?320a?1基因上單核苷酸多態性位點的基因型；所述的引物對P2為：上游引物：5`?AACTCCCACGTTGCGTCCAGC?3`；下游引物：5`?GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT?3`。

【技術特征摘要】
1.一種秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：以待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P2為引物，PCR擴增秦川牛microRNA-320a-1基因片段；用限制性內切酶PvuII酶切PCR擴增得到的片段，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定秦川牛microRNA-320a-1基因上單核苷酸多態性位點的基因型；所述的引物對P2為：上游引物：5`-AACTCCCACGTTGCGTCCAGC-3`；下游引物：5`-GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT-3`。2.如權利要求1所述的秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序為：94℃預變性2min；94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸15s，30～36個循環；72℃延伸5min。3.如權利要求1所述的秦川牛microRNA-320a-1基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳采用質量濃度為3％的瓊脂糖凝膠。4.如權利要求1所述的秦川牛microRNA-320...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宏，董冬，魏雪鋒，白躍宇，黃永震，藍賢勇，雷初朝，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61