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    一種霉菌毒素濃度檢測方法技術

    技術編號:14902244 閱讀:96 留言:0更新日期:2017-03-29 17:37
    本發明專利技術公開了一種霉菌毒素濃度檢測方法,包括如下步驟:取待測霉菌毒素結晶母液回收乙醇后的廢水,降至常溫,用鹽酸將pH調至4?5之間,按0.05?0.07億霉菌毒素單位/升樹脂量·小時的速度通入裝有CD180樹脂的樹脂柱動態吸附,樹脂柱的高/徑為3?5:1,采用薄層層析法檢測解析液成分,有霉菌毒素B漏吸時停止吸附;水洗樹脂至硝酸銀測定無C1離子,水洗結束。本發明專利技術首先霉菌毒素進行提取,在進行濃度檢測,對試驗條件要求不高,施行方便,成本低。

    Method for detecting mycotoxin concentration

    The invention discloses a mycotoxin concentration detection method, which comprises the following steps: measuring wastewater, crystallization of mycotoxin mother liquor recovery after ethanol to room temperature, using hydrochloric acid pH to 4 5, according to the 0.05 7 million mycotoxin units / liter per hour speed through the amount of resin into the resin column with dynamic adsorption CD180 resin, the resin column height / diameter of 3 5:1, detected by thin layer chromatography analytical solution composition, stop adsorption of mycotoxins B leakage of suction; Determination of C1 ion washing resin to silver nitrate, washing end. The present invention has the advantages that: firstly, the mycotoxin is extracted, the concentration is detected, the test conditions are not required, the implementation is convenient, and the cost is low.

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及一種檢測方法,具體是一種霉菌毒素濃度檢測方法。
    技術介紹
    霉菌是一種多細胞微生物,廣泛存在于自然界中,在微生物學上屬于真菌。其通過孢子的形式繁衍。霉菌毒素是由霉菌或真菌產生的有毒有害物質。在土壤中,在植物上,包括谷物、飼草和青貯飼料均可發現霉菌毒素。高溫高濕的環境條件通常有利于飼料中霉菌的生長和霉菌毒素的產生。迄今為止已經分離和鑒定出來的霉菌毒素有300多種。一般而言,霉菌毒素主要是由4種霉菌屬所產生:曲霉菌屬(主要分泌黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等)、青霉菌屬(主要分泌橘霉素等)、麥角菌屬(主要分泌麥角毒素)、鐮孢菌屬(主要分泌玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素、串珠鐮孢菌毒素),也是最見的幾種霉菌毒素。霉菌毒素對動物的危害是世界性的問題,霉菌大多屬于中溫型微生物,最適宜生長溫度一般為20~30℃,霉菌繁殖產毒的最適溫度為25~30℃,其中曲霉菌屬最適宜生長溫度為30℃,青霉屬為28℃左右,鐮刀菌一般為20℃左右,一般危害飼料的霉菌孢子在7℃時即可發芽,溫度高于49℃時霉菌會被殺死或進入孢子階段。霉菌毒素的危害主要體現在兩方面,第一養禽業:種禽攝入霉變飼料容易出現產蛋下降、受精率下降、孵化率下降;子代生長不良,發生腸道綜合癥且難以控制。肉雞攝入霉變飼料后,機體容易出現腹水、腎腫、生長不良等癥狀,還會導致疫苗免疫失敗,容易誘發新城疫、傳支、流感等病毒性傳染病,臨床難以控制。第二方面人類健康:霉菌毒素在畜產品中的殘留會對人體健康產生影響。目前霉菌毒素已成為食品安全的最大隱患,影響到人類健康。畜禽食品被污染后,人食用會發生急、慢性中毒,或出現致畸、致癌、致突變。中國是農業大國,但中國種殖業比重較大的是農戶散養或者小型養殖場養殖,規模分散,植物霉菌毒素類疫病防治水平和生產管理能力落后,在發生疫病流行時,難以有效控制。存在著作物領域監管對像種類多、數量大、分布廣、規模不一等問題,尤其作物環節中具有極強的隱蔽性和時間性的特點,現場執法檢查如果靠眼面檢查從根本上不能積習難改現其問題和隱患。傳統實驗檢測也存在程序復雜、檢測時間長的技術問題,檢測結果出來后產品已經銷售或轉移,無法及時處理,無法滿足現場檢測需要及時、高效、快速的需要。而且,目前成熟的快速檢測技術大多是針對單一疫病或者藥物殘留進行,也難以達到對檢測樣品種類多樣、檢測項目繁多的檢測的目的。隨著生物技術的發展,開始用生物技術來對植物疫病、植物產品質量進行安全檢測。比如PCR檢測法、酶聯免疫法(ELISA)和操作比較簡單的動物疫病免疫層析檢測方法,PCR檢測法常用于核酸方面的檢測,敏感度好且準確性相對較高,酶聯免疫法常用于檢測獸藥殘留及動物疫病,具有特異性和靈敏度比較高的優點,對于現場初篩有較好的應用前景,但這兩者都需要專業的儀器設備和操作人員進行檢驗操作,對試驗條件要求較高,施行不方便,成本高。
    技術實現思路
    本專利技術的目的在于提供一種霉菌毒素濃度檢測方法,以解決上述
    技術介紹
    中提出的問題。為實現上述目的,本專利技術提供如下技術方案:一種霉菌毒素濃度檢測方法,包括如下步驟:(1)取待測霉菌毒素結晶母液回收乙醇后的廢水,降至常溫,用鹽酸將pH調至4-5之間,按0.05-0.07億霉菌毒素單位/升樹脂量·小時的速度通入裝有CD180樹脂的樹脂柱動態吸附,樹脂柱的高/徑為3-5:1,采用薄層層析法檢測解析液成分,有霉菌毒素B漏吸時停止吸附;水洗樹脂至硝酸銀測定無C1離子,水洗結束;然后用濃度為1.0mol/L、流速按每小時樹脂體積的0.6倍的氨水解析,當解析液單位低于300U/ml時,停止解析,收集解析液,得到含少量雜質、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液,經測定其中含雜質占10-15%,霉菌毒素A占50-55%,霉菌毒素B占20-35%;(2)將步驟(1)得到的混合解析液用鹽酸調pH3-4之間,測定解析液的單位,按解析液單位總億數乘以4-5再除以每毫升樹脂的吸附容量,以此來確定CD180樹脂的用量,每毫升樹脂的吸附容量為10-12萬單位,將上述量樹脂投入分離柱,分離柱的高徑比10-20:1,按每小時0.08-0.12倍樹脂體積的流速通入解析液進行吸附,解析液通完吸附完畢;用水洗樹脂至硝酸銀測定無Cl離子,然后用濃度為0.2mol/L氨水按每小時樹脂量的0.04-0.06倍的流速解析,檢測解析液的單位,解析過程中檢測到解析液中出現雜質時開始收集含雜質的解析液,檢測到解析液中出現霉菌毒素A時停止收集含雜質的解析液而開始收集含霉菌毒素A的解析液,檢測到解析液中出現霉菌毒素B時停止收集含霉菌毒素A的解析液而開始收集含霉菌毒素B的解析液,當解析液單位低于300U/ml時,停止解析,含霉菌毒素B的解析液收集完畢;(3)將能夠特異性識別霉菌毒素的核酸適配體P1和模板DNA片段P混合,P1的3’端堿基與P的3’端互補結合形成P-P1;(4)待測樣品中的霉菌毒素與核酸適配體P1結合,使得P1與P分開;(5)加入外切酶Ⅲ,外切酶Ⅲ作用于體系中的P-P1,將P序列中與下游引物互補端的DNA序列切斷,使P不能進行PCR擴增循環,但卻不能剪切游離的P,P作為模板在下游引物P2的作用下,進行PCR擴增;(6)通過檢測Ct值確定霉菌毒素的量。作為本專利技術進一步的方案:所述的模板DNA片段P、核酸適配體P1、下游引物P2的序列具有如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。作為本專利技術再進一步的方案:所述步驟(2)中分離柱的高徑16-18:1。與現有技術相比,本專利技術的有益效果是:本專利技術首先霉菌毒素進行提取,在進行濃度檢測,對試驗條件要求不高,施行方便,成本低。具體實施方式下面對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。本專利技術實施例中,一種霉菌毒素濃度檢測方法,包括如下步驟:(1)取待測霉菌毒素結晶母液回收乙醇后的廢水,降至常溫,用鹽酸將pH調至4-5之間,按0.05-0.07億霉菌毒素單位/升樹脂量·小時的速度通入裝有CD180樹脂的樹脂柱動態吸附,樹脂柱的高/徑為3-5:1,采用薄層層析法檢測解析液成分,有霉菌毒素B漏吸時停止吸附;水洗樹脂至硝酸銀測定無C1離子,水洗結束;然后用濃度為1.0mol/L、流速按每小時樹脂體積的0.6倍的氨水解析,當解析液單位低于300U/ml時,停止解析,收集解析液,得到含少量雜質、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液,經測定其中含雜質占10-15%,霉菌毒素A占50-55%,霉菌毒素B占20-35%;(2)將步驟(1)得到的混合解析液用鹽酸調pH3-4之間,測定解析液的單位,按解析液單位總億數乘以4-5再除以每毫升樹脂的吸附容量,以此來確定CD180樹脂的用量,每毫升樹脂的吸附容量為10-12萬單位,將上述量樹脂投入分離柱,分離柱的高徑比10-20:1,按每小時0.08-0.12倍樹脂體積的流速通入解析液進行吸附,解析液通完吸附完畢;用水洗樹脂至硝酸銀測定無Cl離子,然后用濃度為0.2mol/L氨水按每小時樹脂量的0.04-0.06倍的流速解析,檢測解析液的單位,解析過程中檢測到解析液中出現雜質時開始收集含雜質的解析液,檢測到解析液中出現霉菌毒素A時停止收集含雜質的解析液而開始收集含霉菌毒素A的解本文檔來自技高網
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    【技術保護點】
    一種霉菌毒素濃度檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:(1)取待測霉菌毒素結晶母液回收乙醇后的廢水,降至常溫,用鹽酸將pH調至4?5之間,按0.05?0.07億霉菌毒素單位/升樹脂量·小時的速度通入裝有CD180樹脂的樹脂柱動態吸附,樹脂柱的高/徑為3?5:1,采用薄層層析法檢測解析液成分,有霉菌毒素B漏吸時停止吸附;水洗樹脂至硝酸銀測定無C1離子,水洗結束;然后用濃度為1.0mol/L、流速按每小時樹脂體積的0.6倍的氨水解析,當解析液單位低于300U/ml時,停止解析,收集解析液,得到含少量雜質、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液,經測定其中含雜質占10?15%,霉菌毒素A占50?55%,霉菌毒素B占20?35%;(2)將步驟(1)得到的混合解析液用鹽酸調pH3?4之間,測定解析液的單位,按解析液單位總億數乘以4?5再除以每毫升樹脂的吸附容量,以此來確定CD180樹脂的用量,每毫升樹脂的吸附容量為10?12萬單位,將上述量樹脂投入分離柱,分離柱的高徑比10?20:1,按每小時0.08?0.12倍樹脂體積的流速通入解析液進行吸附,解析液通完吸附完畢;用水洗樹脂至硝酸銀測定無Cl離子,然后用濃度為0.2mol/L氨水按每小時樹脂量的0.04?0.06倍的流速解析,檢測解析液的單位,解析過程中檢測到解析液中出現雜質時開始收集含雜質的解析液,檢測到解析液中出現霉菌毒素A時停止收集含雜質的解析液而開始收集含霉菌毒素A的解析液,檢測到解析液中出現霉菌毒素B時停止收集含霉菌毒素A的解析液而開始收集含霉菌毒素B的解析液,當解析液單位低于300U/ml時,停止解析,含霉菌毒素B的解析液收集完畢;(3)將能夠特異性識別霉菌毒素的核酸適配體P1和模板DNA片段P混合,P1的3’端堿基與P的3’端互補結合形成P?P1;(4)待測樣品中的霉菌毒素與核酸適配體P1結合,使得P1與P分開;(5)加入外切酶Ⅲ,外切酶Ⅲ作用于體系中的P?P1,將P序列中與下游引物互補端的DNA序列切斷,使P不能進行PCR擴增循環,但卻不能剪切游離的P,P作為模板在下游引物P2的作用下,進行PCR擴增;(6)通過檢測Ct值確定霉菌毒素的量。...

    【技術特征摘要】
    1.一種霉菌毒素濃度檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:(1)取待測霉菌毒素結晶母液回收乙醇后的廢水,降至常溫,用鹽酸將pH調至4-5之間,按0.05-0.07億霉菌毒素單位/升樹脂量·小時的速度通入裝有CD180樹脂的樹脂柱動態吸附,樹脂柱的高/徑為3-5:1,采用薄層層析法檢測解析液成分,有霉菌毒素B漏吸時停止吸附;水洗樹脂至硝酸銀測定無C1離子,水洗結束;然后用濃度為1.0mol/L、流速按每小時樹脂體積的0.6倍的氨水解析,當解析液單位低于300U/ml時,停止解析,收集解析液,得到含少量雜質、霉菌毒素A和霉菌毒素B的混合解析液,經測定其中含雜質占10-15%,霉菌毒素A占50-55%,霉菌毒素B占20-35%;(2)將步驟(1)得到的混合解析液用鹽酸調pH3-4之間,測定解析液的單位,按解析液單位總億數乘以4-5再除以每毫升樹脂的吸附容量,以此來確定CD180樹脂的用量,每毫升樹脂的吸附容量為10-12萬單位,將上述量樹脂投入分離柱,分離柱的高徑比10-20:1,按每小時0.08-0.12倍樹脂體積的流速通入解析液進行吸附,解析液通完吸附完畢;用水洗樹脂至硝酸銀測定無Cl離子,然后用濃度為0.2mol/L氨水按每小時樹脂量的0.04...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:蔣韋艷劉金杰吳敏芳徐靜趙春城胡勇朱倩倩
    申請(專利權)人:無錫艾科瑞思產品設計與研究有限公司
    類型:發明
    國別省市:江蘇;32

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